《Current Opinion in Structural Biology》：Conformational landscapes in cryo-electron tomography data based on molecular dynamics simulations
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冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography，cryo-ET）为观察细胞环境（原位，in situ）中的分子组织提供了一个独特的窗口。然而，cryo-ET数据的一些固有特性，如噪声、缺失楔（missing wedge）以及分子的连续构象变
冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography，cryo-ET）为观察细胞环境（原位，in situ）中的分子组织提供了一个独特的窗口。然而，cryo-ET数据的一些固有特性，如噪声、缺失楔（missing wedge）以及分子的连续构象变异性，使分子结构信息的解析变得复杂。这些挑战将重点从高分辨率结构测定转向低分辨率密度图的验证和解释以及构象柔性的分析。分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟特别适合这项任务，因为它们提供了一种基于物理的方式来探索与实验数据和分子能量学一致的连续构象转变。本综述聚焦于MD模拟在cryo-ET中的作用，强调其在构象景观测定的新兴方法中的应用。
构象景观表示：原子或粗粒化模型空间与密度图空间
近年来，用于cryo-ET构象异质性分析的深度学习方法，如tomoDRGN、cryoDRGN-ET和cryoDRGN-AI，突显了从断层扫描数据重建构象景观的日益增长的兴趣。这些方法从二维颗粒倾斜图像中推断低维构象景观，无需先验原子模型即可实现连续构象变异性的可视化。此类方法输出的构象景观以颗粒密度图预测的形式表达，而非显式的原子模型或轨迹。相比之下，基于动力学模拟的混合方法，如MDTOMO和HEMNMA-3D，输出的构象景观则以原子或粗粒化模型的形式表达。其中，MDTOMO将经典MD模拟（基于牛顿运动方程）与cryo-ET数据相结合，在实验观察到的异质性与物理上合理的构象转变模型之间建立了直接联系。
经典MD模拟与cryo-ET数据的整合：与单颗粒冷冻电镜的概念桥梁
早期的基于MD的冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）方法证明了cryo-EM密度图如何引导MD轨迹以精修原子模型，但这些方法聚焦于从共识图中获取原子模型，并未解决颗粒间的变异性。HEMNMA及其深度学习扩展DeepHEMNMA基于简正模对颗粒图像进行柔性拟合，引入了对二维cryo-EM图像中连续变异性的分析。MDSPACE将该逐颗粒柔性拟合框架扩展为完全由MD驱动的、受cryo-EM数据引导的构象景观推断。HEMNMA-3D和MDTOMO将这些范式扩展到cryo-ET数据分析。MDTOMO是MDSPACE的cryo-ET扩展：两者均执行逐颗粒的基于MD的柔性拟合和景观推断，但区别在于实验约束来源于二维cryo-EM单颗粒图像（MDSPACE）还是三维亚断层图像（MDTOMO）。
经典MD模拟与简正模在cryo-ET数据构象景观测定中的比较
在目前可用的方法中，MDTOMO通过将经典MD模拟与实验亚断层图像数据分析相结合，实现了从cryo-ET数据测定原子级构象景观。在MDTOMO中，MD模拟受源自cryo-ET亚断层图像密度的力引导，能够将分子模型柔性拟合到单个亚断层图像中。MDTOMO产生一组位于高维构象景观上的结构，其低维投影揭示了不同构象状态之间的关系和构象变异性的主导模式。HEMNMA-3D提供了一种互补方法，利用给定初始模型的简正模来分析cryo-ET亚断层图像。HEMNMA-3D依赖弹性网络模型描述低频集体运动，通过改变简正模振幅对亚断层图像进行柔性拟合，得到与实验亚断层图像一致的构象景观近似。HEMNMA-3D不包含显式原子相互作用，但提供了实际景观的快速近似，无需先验姿态知识，并允许使用非原子初始模型。
cryo-ET数据构象景观测定的先验结构知识与先验姿态估计
目前从cryo-ET数据测定构象景观的方法可分为基于参考的方法和无参考的方法。基于参考的方法需要先验结构信息，可以是来自数据本身的密度图（如亚断层图像平均）或可用的原子或粗粒化结构。无参考方法可能需要先验结构信息用于颗粒姿态估计，但构象分析不需要。需要先验姿态估计的方法可能在构象分析期间精修姿态或保持姿态固定。初始颗粒姿态可通过经典分类和比对程序获得。然而，由于结构异质性，从离散分类获得的姿态可能对某些颗粒不准确，若在单个亚断层图像的构象分析中未能纠正这些姿态误差，可能导致所得构象状态不准确。或者，颗粒姿态可以与构象状态同时估计，无需先验姿态估计，这可通过基于参考和无参考的方法实现。
cryo-ET数据构象景观的原子空间与密度空间表示的互补作用
原子空间和密度空间表示方法应被视为互补的。首先，当启动MD模拟所需的原子模型不可用时，密度空间方法可以提供初始密度图，随后可用于建模以获得用于MD分析的原子结构。其次，密度空间方法可以促进离散和连续异质性的分离。可先使用密度空间方法识别和分离离散状态，然后应用基于MD或简正模的方法在所得更均匀的类别内表征原子水平的连续构象变异性。更一般地，基于参考的方法假设数据集在组成上是同质的，即可观察到的变异性可归因于生物系统的连续构象变化。因此，它们可以在无参考构象景观方法或经典离散分类程序之后使用，以分离离散和连续异质性。
噪声引起的拟合误差和不确定性
由于cryo-EM/ET数据中噪声水平较高，单个颗粒数据的分析仍具挑战性。若无适当正则化，此类分析可能导致虚假结构特征。为处理噪声引起的拟合误差、探索替代构象并显式量化不确定性，已提出多种策略。MDTOMO可在拟合过程中使用副本交换伞形采样（replica-exchange umbrella sampling，REUS）增强采样技术，以减少噪声引起的拟合误差，同时探索与数据兼容的多种构象。REUS通过在不同偏置势权重下并行模拟多个系统副本，并在副本间进行交换，促进构象空间的高效探索并减轻拟合误差。或者，可采用事后方法减少噪声引起的拟合误差，如在所得构象景观内局部平均单个原子模型和相应的亚断层图像。虽然REUS和事后平均减轻了噪声对拟合的影响，但贝叶斯方法通过可能构象上的统计分布显式表示不确定性。与贝叶斯方法不同，MDTOMO沿具有物理连通性的轨迹进行采样，从初始状态朝向与颗粒数据一致的构象。尽管最终景观中的状态并非由MD轨迹直接连接，但可基于景观中的邻近性推断状态间关系，这也允许在景观状态之间进行定向MD或靶向MD模拟以探测转变途径。
从作为验证和解释工具的MD模拟到原位原子构象景观
基于MD的验证和解释性cryo-ET研究与新兴的基于MD的构象景观测定方法之间的关键区别在于对结构变异性的处理。在验证和解释的背景下，MD模拟主要用于事后评估cryo-ET观察到的特定结构或相互作用几何形状的物理合理性、稳定性或局部动力学，并不旨在从断层扫描数据重建单个大分子的连续构象变异性。相比之下，在构象景观测定背景下，MD模拟通过柔性拟合与cryo-ET数据分析相结合。在目前可用的方法中，MDTOMO是唯一将经典MD模拟与cryo-ET数据相结合以生成原子级构象景观的方法。HEMNMA-3D通过使用基于简正模分析的简化力学模拟提供了一种计算高效的替代方案。MDTOMO帮助测定了SARS-CoV-2刺突糖蛋白原位的构象景观，超越了离散的亚断层图像平均，检测到平均方法无法获取的变异性，如刺突结构域的独立运动。HEMNMA-3D首次表征了原位核小体的呼吸和张开运动。许多生物系统是从事后基于MD的解释扩展到构象景观推断的自然候选者，包括病毒表面蛋白、细菌和古菌表面组装体以及细胞骨架马达系统。
未来数据质量和计算速度的改进
未来，与建模和模拟方面的持续方法学进展并行，cryo-ET样品制备、仪器以及计算工作流程和基础设施的进一步进展对于充分发挥原位原子尺度构象景观推断的潜力至关重要。样品玻璃化、聚焦离子束铣削和薄片制备的改进有望产生更薄、更均匀的样品。在仪器方面，相位板、直接电子探测器、能量过滤以及剂量分配和倾斜方案策略的优化将进一步提高cryo-ET数据的信噪比。结合缺失楔校正、去噪和颗粒拾取计算方法的进展，这些发展将提高从cryo-ET数据中检测和量化细微构象异质性的保真度。计算能力和模拟效率的持续增长将使MD驱动的构象景观推断应用于更大系统和更长时间尺度变得越来越可行。
基于MD的方法的当前局限性和未来方向
尽管基于MD的构象景观测定方法取得了相当大的进展，但仍存在若干重要挑战。与所有基于MD的方法一样，所得构象景观取决于底层分子表示、所用力场以及实验cryo-ET信息纳入模拟的方式。此外，这些方法主要设计用于重现实验观察到的结构变异性，因此将所得轨迹解释为物理动力学的表示应谨慎对待。其他挑战包括与大系统相关的巨大计算成本、将这些方法应用于日益复杂的原位数据集，以及缺乏用于定量验证的明确定义的基准真值。未来的工作应侧重于系统基准测试、提高计算效率，以及更好地理解力场、约束设计、实验噪声和初始条件对重建构象景观的影响。
超越单个分子复合物的构象景观
目前原子尺度构象景观推断方法的范围仍然有限。迄今为止，MDTOMO和HEMNMA-3D主要展示在单个相对紧凑的大分子复合物上。将这些方法扩展到更大、更复合的系统，如染色质纤维内的多个相互作用核小体、弯曲膜内嵌入的膜蛋白复合物阵列，或菌毛、S层或细胞骨架丝内的重复组装体，提出了重大的概念和计算挑战。此类系统表现出集体多体构象变异性、长程机械耦合以及周围细胞环境施加的强几何约束。应对这些挑战需要若干方法学进展，包括构象变异性的可扩展表示、改进的cryo-ET分割和情境建模策略，以及高效的构象采样方案。另一方面，深度学习框架可以成为解决此类大型组装体在细胞环境中动力学的更高效替代方案，其可将复杂信息高效嵌入紧凑的低维表示，可能用于从大型cryo-ET数据集中嵌入大型组装体的多尺度动力学，随后通过MD模拟对嵌入进行原子解释。
