《Current Opinion in Structural Biology》：From molecular aggregates to neurodegenerative networks: Integrating electron and X-ray imaging across scale
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神经退行性病变跨越多个尺度展开，从纳米尺度的蛋白质组装体到毫米尺度的组织重组。本综述探讨了电子和X射线方法如何连接这些层次。单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）可解析分离的分子组装体，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）将其置于天然细胞环境中，而体电子显微镜（
神经退行性病变跨越多个尺度展开，从纳米尺度的蛋白质组装体到毫米尺度的组织重组。本综述探讨了电子和X射线方法如何连接这些层次。单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）可解析分离的分子组装体，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）将其置于天然细胞环境中，而体电子显微镜（volume EM）则描绘其在细胞和组织间的组织分布。X射线相衬成像（XPCT）和叠层衍射断层扫描（ptychographic tomography）能够对细胞和组织进行无损三维成像，而扫描X射线衍射揭示分子组织，扫描X射线荧光识别元素的空间分布。我们还讨论了组织病理学和荧光如何指导靶点选择，新兴方法如何将成像扩展到更厚的标本，以及人类死后组织和实验模型如何提供互补证据。总之，这些方法形成了一个连接分子结构、细胞病理学和组织水平神经退行性病变的成像连续体。
引言
神经退行性病变无法仅在一个生物尺度上被理解。在许多疾病中，病理始于蛋白质构象或组装状态的改变，但只有当这种分子事件改变细胞器、破坏突触稳定性、扰乱细胞间相互作用并重塑组织结构时，才具有临床重要性。分子图谱、空间转录组学和生理学研究可以识别易感细胞群和疾病轨迹，但它们无法显示这些状态是如何物理组织的。结构成像通过揭示聚集体在哪里积累、它们接触哪些膜、细胞器如何重塑以及局部病理如何在更广泛的神经组织中嵌入，增加了这一缺失的层面。本综述将电子和X射线成像呈现为集成结构工作流程中的互补方法，连接分子水平的细节与细胞组织及组织尺度的结构。主要问题不在于哪种方法普遍更优，而在于每种方法最适合回答哪个生物学问题，其局限性何时变得重要，以及何时需要另一种模态来提供缺失的信息。冷冻单颗粒分析（cryo-SPA）解析分离的分子组装体。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）在三维细胞环境中保存大分子、膜和细胞器。体电子显微镜（volume EM）将分析扩展到多细胞邻域和环路。X射线相衬和叠层衍射断层扫描在更大的组织体积内保留三维坐标，而扫描X射线衍射和荧光则提供关于分子有序性和元素组成的空间分辨信息。荧光关联增加了分子特异性，并在破坏性电子成像前帮助选择稀有靶点。人体组织和实验模型提供了不同但互补的证据。人死后大脑保留了与疾病相关的大分子组装体，这些组装体处于由区域易感性、衰老、治疗暴露和共病病理塑造的解剖和细胞背景中。然而，其解释受到保存条件、死亡间隔、临床病史和疾病阶段差异的限制，以及主要来自晚期材料的有限实验对照。动物和细胞模型提供了受控的实验操作、在确定时间点的采样和治疗测试，但可能无法完全再现人类疾病的分子构象、细胞多样性、解剖组织或时间进程。因此，最有价值的研究利用人体组织来识别与神经病理相关的结构特征，而互补的模型系统则阐明这些特征如何产生、进展以及对治疗的反应。可靠的解释不仅取决于收集到的粒子或图像数量，还取决于是否在不同生物样本中观察到相同的发现。平均化可以提高cryo-SPA和螺旋重建的分辨率和精度，而在细胞、组织区域、供体、动物和实验准备之间进行采样有助于建立生物学一致性。
冷冻单颗粒分析与病理组装体的分子结构
当关键问题是分子结构时，cryo-SPA是最直接的起点。它能在近原子分辨率下解析配体结合、构象变异性和组装界面。在神经退行性疾病中，这种精度至关重要，因为致病折叠、催化状态和药物结合位点是由分子几何形状决定的。Tau蛋白提供了一个有用的例子。阿尔茨海默病tau纤维与正电子发射断层扫描（PET）配体MK-6240结合的结构显示了示踪剂如何与确定的纤维表面结合，改善了生物标志物结合的解读，并为配体优化提供了结构基础。相关方法也解析了突触V-ATP酶–突触素复合体以及代谢和蛋白质稳态酶的构象循环。cryo-SPA的主要局限性源于使其如此强大的同一优势：纯化分离了目标分子但移除了其生物学背景。即使是一个近原子结构也无法显示一个组装体是胞质的、膜相关的、细胞器富集的，还是与特定细胞状态相关的。它也抑制了体内所见的大部分异质性。因此，cryo-SPA提供了基本的分子细节，但当生物学意义取决于细胞位置、相互作用伙伴、膜接触或组织背景时，就需要cryo-ET。
冷冻电子断层扫描与原生亚细胞结构
当在原位应用时，cryo-ET通过在三维空间中重建玻璃化的细胞、细胞器或组织，保留了生化分离过程中丢失的空间背景。它展示了蛋白质和病理组装体相对于膜、囊泡、细胞骨架元件和细胞器的位置，这对于理解它们的细胞位置和局部相互作用如何影响神经退行性变至关重要。人死后组织提供了人类疾病神经病理最直接的结构证据。对阿尔茨海默病大脑的cryo-ET揭示了异质性的Aβ纤维、原丝样结构、细胞外囊泡和其他斑块相关成分，以及局部组织的tau纤维簇，其特性随亚细胞位置而变化。这些发现表明，与疾病相关的组装体嵌入了复杂的细胞环境，而这些环境在提取过程中丢失了。然而，解释时需要谨慎，因为死亡间隔、冷冻和组织处理历史会影响超微结构的保存，特别是膜的保存。实验模型允许在受控条件下研究机制性问题。例如，在接种的原代神经元中，cryo-ET显示了α-突触核蛋白纤维位于线粒体、内质网、自噬溶酶体结构和囊泡之间，同时区分了邻近性与直接膜接触。Cryo-ET还解析了结构完整的胞内体-溶酶体中的膜蛋白，并揭示了轴突修复期间微管和细胞器是如何排列的。在小鼠中，一种明确的合成α-突触核蛋白毒株保持了其结构，诱导了类似多系统萎缩（MSA）的病理，并重现了患者来源纤维中发现的核心折叠。这些研究共同展示了模型系统所能揭示的内容，同时也强调它们与人类疾病的相关性必须针对每个模型和结构特征进行评估。Cryo-ET仍然受到样本厚度、视场和通量的限制。细胞和组织通常需要减薄至约100–250 nm，每个断层扫描图只捕获一个小的局部体积。因此，该方法最适合于有关局部三维组织的问题，而非某个特征在扩展组织区域内的普遍性。荧光引导靶向可以改善位点选择并减少不成功的薄片制备，而volume EM和X射线断层扫描可以提供更广泛的细胞和组织背景，以确定选定的cryo-ET位点是否能代表更大的病理模式。
病理界面与突触重塑
许多神经退行性变化出现在关键的细胞界面，包括突触、轴突-髓鞘接触和细胞外囊泡通路。在这些位点，膜几何形状、分子锚定、拥挤和大分子组织影响信号传导、货物转移和结构稳定性。结构成像特别有价值，因为它直接在细胞背景下揭示这些关系，而不是仅从分子组成推断它们。突触提供了一个清晰的例子。早期的超微结构工作将结构性突触重塑与可塑性和记忆联系起来，并显示突触前线粒体结构与突触性能相关。最近的cryo-EM和cryo-ET研究揭示了突触囊泡上一个确定的V-ATP酶–突触素界面，而改进的cryo-ET工作流程现在可以进入大的质膜区域及其相关蛋白。Tau纤维也被证明锚定在阿尔茨海默病脑细胞外囊泡的腔内，揭示了一种可能与囊泡介导的传播相关的有组织的货物状态。流感组装的原位研究通过直接在细胞表面可视化膜重塑、大分子组织和病毒出芽，提供了一个有用的方法论比较。Cryo-ET可以定义突触、囊泡或轴突-胶质界面的局部三维结构，但其受限的采样体积使其不太适合确定一个结构状态在组织中的分布广泛程度。关于普遍性、细胞邻域和区域选择性的问题自然引向了volume EM。
体电子显微镜与组织结构
Volume EM将结构分析从局部超微结构扩展到三维细胞和组织组织。聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）、连续块面SEM、自动化连续切片成像及相关方法以纳米级采样重建组织体积，使得突触、轴突、树突、胶质细胞、细胞器和血管可以在同一个数据集中进行检查。其主要优势在于比cryo-ET提供更广泛的空间背景和采样。Volume EM可以确定一个局部特征是否在成像体积内重复出现，以及它在细胞、区室和通路中如何分布，尽管对区域普遍性的估计仍需要系统性采样和生物学重复。一项大型小鼠新皮层重建将细胞器、细胞类型、突触和连接性与功能成像联系起来，而成体果蝇的全脑EM实现了覆盖全脑的环路重建。人类应用仍然较为有限，但现在包括对死后皮层中三维突触纳米结构的研究；更广泛的人体组织和多发性硬化症研究强调了EM在检查轴突、髓鞘、胶质细胞和病变超微结构方面的价值。动物和人类数据集提供互补证据。动物研究允许受控固定、遗传或分子标记、确定的疾病阶段和匹配的对照，而人死后组织提供了直接的疾病相关性，但受到保存、死亡间隔、临床病史和疾病阶段差异的影响。因此，在定量比较之前，样本质量评估和匹配处理至关重要。大多数volume EM工作流程使用固定的、重金属染色的和树脂包埋的组织，而非玻璃化标本，限制了近天然状态的保存和内在分子鉴定。制备和分割仍然要求很高。因此，Volume EM非常适合解决组织结构与空间分布的问题，而局部大分子几何形状可能需要互补的cryoET或cryo-SPA。
组织病理学作为死后参考框架
基于固定薄切片的常规神经病理学仍然是死后评估和分类神经退行性疾病的参考框架。常规组织学和银染揭示组织和包涵体形态，而免疫组织化学识别疾病相关蛋白，包括阿尔茨海默病中的Aβ和磷酸化tau、路易体病理中的α-突触核蛋白以及额颞叶变性伴TDP-43蛋白病（FTLD-TDP）中的TDP-43。这些成熟且相对易得的方法提供了无标记电子和X射线成像通常缺乏的分子特异性。一个核心局限性是二维采样：薄切片会中断连续结构，可能会遗漏采样层面之间的稀疏特征，并且不能完整捕捉包涵体、血管、细胞邻域和轴突通路的三维几何形状。因此，多尺度成像应补充而非取代已建立的神经病理学。组织病理学确定病变身份并指导区域选择；荧光关联完善分子靶向；X射线断层扫描保持体积连续性；volume EM绘制局部组织结构；cryo-ET从大分子到细胞器尺度解析选定位点。维持这种关系在人死后研究中尤为重要，其中结构观察应始终锚定于既定的神经病理学分类。
X射线成像：不同技术应对不同问题
X射线成像弥合了光学组织学和电子显微镜之间的空间差距，但其主要技术提供不同类型的信息。相衬、全息和叠层衍射断层扫描从未切片或最小限度切片的标本中重建三维组织结构。相比之下，扫描X射线衍射和荧光逐点分析薄切片以绘制分子有序性和元素组成图，其空间分辨率主要由束斑尺寸和扫描步长决定。这个区别很重要，因为断层扫描主要用于保留体积组织背景，而扫描方法用于表征局部结构和化学性质。相衬断层扫描（XPCT）对于弱吸收的软组织特别有用。基于传播的方法将相位差转换为强度对比，全息纳米断层扫描从相干传播测量中重建相位，而叠层衍射断层扫描（PXCT）使用重叠的相干衍射图案和计算相位恢复。剂量、视场、采集时间、重建要求和标本稳定性制约着性能。主要优势是在破坏性切片或铣削之前保留三维组织几何形状，尽管制备可能包括固定、染色或包埋。例如，PXCT已在染色的鼠脑组织中以低于40 nm的各向同性分辨率解析了神经突起和突触特征，同时保留标本用于后续的volume EM。人死后应用证明了这种连续性的价值。相关性XPCT和组织学绘制了阿尔茨海默病海马的三维细胞结构。而多尺度XPCT可视化了固定的人神经退行性组织中神经元包涵体和聚集体相关结构，并将其形态与相关性组织学联系起来。这些研究直接在人体组织中检查病理，并揭示了包涵体类别和采样组织区域之间的差异，但解释仍受固定、死亡间隔、疾病阶段和横截面采样的影响。临床前XPCT提供了互补的实验控制。在阿尔茨海默病和多发性硬化症模型中的研究在三维中可视化了神经元、血管和病变相关的变化。在老龄和3xTgAD小鼠中，多尺度X射线成像检测到了神经元和胶质细胞的变化，并识别了对mGlu2/3受体刺激有反应的区域。此类模型允许对基因型、年龄和治疗进行受控比较，但与人类疾病分子组成和进展的对应关系必须被证明而非假设。因此，X射线断层扫描既可以作为分析三维组织结构的终点，也可以作为靶向电子成像前的配准层。非破坏性PXCT和相关显微断层扫描/volume EM工作流程利用X射线成像指导下游电子显微镜，而全息纳米断层扫描则在更大的组织体积上重建密集的神经元结构。X射线断层扫描通常缺乏内在的蛋白质特异性和定义大分子界面所需的分辨率；其主要贡献是保留了解剖图谱，在此图谱内，组织病理学、volume EM和选定的更高分辨率成像可以被解读。
扫描X射线衍射和荧光
扫描X射线衍射和X射线荧光（XRF）提供空间分辨的成分信息，而非断层扫描解剖结构。在每个光栅位置，小角或广角衍射记录倒易空间的散射，报告特征长度尺度、取向和结构异质性，而扫描网格保留主要由束斑尺寸和扫描步长决定的实空间定位。X射线荧光记录元素特异性发射，可以绘制生物相关元素的分布图，包括铁、铜、锌和钙，具体取决于采集条件。这些方法共同揭示了在常规透射光图像中可能较弱或不存在的结构和元素对比度。在人类黑质切片中，Carboni等人检测到衍射对比度的差异，并发现帕金森病组织中的铁含量较高而铜信号较低。Joppe等人随后分析了来自帕金森病和对照大脑的53个黑色素阳性神经元。铜提供了最强的组间区分，尽管个体间和个体内的巨大差异阻止了简单的分类。对两个路易体的XRF分析揭示了异质性的元素分布，而衍射则识别了富含β-折叠的晶体特征。这些测量是空间配准的散射和元素图谱，而非三维重建：它们的实空间分辨率主要由束斑尺寸和扫描步长决定，而衍射信号则在更小的长度尺度上探测结构有序性。Nepal等人使用扫描X射线微衍射在薄阿尔茨海默病脑切片中绘制了蛋白质相关特征和亚微米散射空洞，并将测量结果与银染组织学相关联。这些空洞被解释为可能是组织脆弱性或丢失的指标，而非特定的分子结构。因此，仔细与组织学关联并控制标本制备、辐射暴露和扫描条件对于避免过度解读散射图案至关重要。
荧光关联、更厚样品与多模态解读
荧光关联有助于为EM中表现为未标记密度的结构分配分子身份。荧光蛋白、染料、抗体和病理标记物可以识别稀有细胞、包涵体、细胞器和膜结构域，而关联光镜和电镜（CLEM）将它们置于超微结构背景中。一种用于固定人脑组织的室温CLEM方法将免疫荧光信号与EM超微结构联系起来，并可在常规EM实验室中使用。在低温条件下，荧光可以引导冷冻切片或冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削朝向稀有的Aβ和tau相关结构，尽管准确性取决于配准、标记效率、荧光团性能以及最小化样品制备伪影。新的电子成像方法旨在提高对比度、剂量效率和获取更厚标本的能力，其性能由弹性和非弹性散射决定。冷冻电子叠层衍射（cryo-electron ptychography）已产生冷冻水合蛋白质颗粒的低剂量、亚纳米级重建，但仍局限于单颗粒原理验证研究。积分差分相位对比扫描透射电子显微镜（iDPC-STEM）改善了焦内对比度，并实现了血蓝蛋白（KLH）6.5 ?和烟草花叶病毒（TMV）3.5 ?的分辨率。对于较厚的标本，倾斜校正明场STEM已在约500–800 nm的细菌细胞和细胞器中解析了特征，而关联冷冻超分辨显微镜和双轴冷冻STEM断层扫描则将荧光靶点与细胞超微结构联系起来。这些方法仍在发展中，目前是对cryo-ET的补充而非替代。其实际使用还取决于辐射暴露，辐射暴露在不同的成像模式和标本类型中测量方式不同。在PXCT中，辐射暴露通常以戈瑞（Gy）为单位报告吸收剂量，其中1 Gy对应于每千克标本吸收1焦耳的能量。对于染色、树脂包埋的脑组织，每个断层扫描图的剂量范围为1.8 × 107 到 2.7 × 109 Gy。耐辐射树脂可耐受超过1.15 × 1010 Gy而无大规模质量损失，但这些值不能应用于活体或冷冻水合标本。Cryo-EM则以电子通量报告。在300 keV下，40 e- ?-2的通量大约对应120 MGy。胞内体-溶酶体cryo-ET研究对每个倾转系列使用了100–120 e- ?-2。荧光暴露通常由激发剂量或光子预算来描述，而非吸收剂量。在低温条件下，荧光发射器可以被更准确地定位，平均定位不确定性从15.4 ± 4.1 nm降至7.7 ± 3.2 nm。除了这些技术限制，结构图像还必须在其分子和生物学背景中进行解读。类似的超微结构特征可能源于不同的分子机制。形态学本身并不能定义生物学状态，因为相似的超微结构表型可能源自不同的分子机制。单细胞和空间多组学识别细胞状态、分子程序和空间邻域，而关联结构成像则揭示这些特征如何在细胞和组织结构中表达。在一个协调的工作流程中，组织病理学和荧光确定病变和靶点身份；X射线断层扫描保留三维组织坐标；volume EM绘制细胞邻域；cryo-ET在玻璃化标本中解析局部组织；cryo-SPA确定分离组装体的结构。因此，当必须在不同生物学尺度上连接分子身份、空间背景和超微结构时，多模态整合至关重要。
结论
没有任何单一的成像方法能从分子结构到组织功能障碍解释神经退行性变。Cryo-SPA定义了分离的组装体，cryo-ET揭示了它们的局部细胞组织，volume EM重建了更广泛的细胞网络，X射线方法保留了三维组织结构并提供互补的结构或元素信息。因此，它们的价值不在于竞争，而在于它们能如何有效地跨尺度组合。人死后组织提供了疾病相关病理的直接证据，而细胞和动物模型则允许受控的机制测试。组织病理学和荧光确定病变和分子身份。关键挑战是在信息在这些层级之间传递时，保持空间配准、分子身份和生物学变异性。神经退行性变是通过这些尺度之间的相互作用而出现的。病理组装体破坏膜和细胞器，损害通讯和运输，并最终损害神经回路和组织功能。因此，进展不仅取决于实现更高的分辨率，还取决于将分子结构置于其细胞和疾病背景中。集成的多尺度成像可以将孤立的结构观察转化为关于病理如何开始、传播和损害神经系统的机制模型。
