慢性肾脏病中炎症与代谢的昼夜节律重编程

《Renal Failure》：Circadian reprogramming of inflammation and metabolism in chronic kidney disease

　　

背景：慢性肾脏病（CKD）由炎症、纤维化和代谢功能障碍驱动。虽然昼夜节律失调在慢性疾病中已有充分记录，但其对CKD发病机制的具体影响仍不清楚。 方法：研究人员对对照小鼠和CKD小鼠的肾组织进行了四小时间隔的时间序列RNA测序。研究人员使用JTK_CYCLE算法识别节律性基因，并将其分类为在CKD中丢失、获得或维持的基因；随后进行了针对性的生物信息学分析。 结果：肾脏昼夜节律谱显著改变；获得性节律成为主要模式，核心时钟基因表达被破坏。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，CKD中上调的获得性节律基因富集于免疫-炎症通路；这些基因的表达在授时因子时间（ZT）12–16达到峰值，与ZT16时肾脏巨噬细胞浸润水平高于ZT0一致。相反，与营养和能量代谢通路相关的基因在CKD中下调但获得节律性。达格列净改善了肾功能，并恢复了NR1D1和p-BMAL1的昼夜节律表达。 结论：CKD深刻重塑肾脏昼夜节律转录组，驱动免疫-炎症和代谢通路进入适应不良的节律性。此外，达格列净可以部分恢复肾脏核心时钟基因的表达。

慢性肾脏病（CKD）中炎症与代谢的昼夜节律重编程：研究解读

一、研究背景与科学问题

慢性肾脏病（CKD）作为多种肾脏疾病的共同终末期表现，已成为全球性公共卫生问题。尽管炎症、纤维化和代谢功能障碍已被公认是CKD发病机制的重要驱动因素，但其深层机制仍未完全阐明。昼夜节律是生物体内固有的、以约24小时为周期的振荡系统，通过核心时钟基因编码的转录因子构成的自我调节反馈环路，协调分子功能与生物学过程以适应外界环境变化。BMAL1与CLOCK异二聚体构成昼夜节律系统的核心，驱动下游时钟基因（如Pers、Crys、Nr1d1、Nr1d2和Rors）的转录；PER和CRY蛋白复合物水平的升高抑制BMAL1–CLOCK活性，构成主要的负反馈环路；ROR蛋白则激活Bmal1和Clock的表达以维持昼夜节律平衡，对抗NR1D1和NR1D2的抑制作用。

昼夜节律对肾脏至关重要，调控肾小球滤过率、肾血浆流量、水盐排泄、激素信号及代谢等众多生理过程。临床研究已发现昼夜节律紊乱（如非杓型血压表型、睡眠节律紊乱或昼夜节律综合征）与CKD进展相关。动物实验中，光/暗周期逆转可加重CKD进展，而限时喂养则可逆转CKD进展。既往研究多聚焦于Bmal1和Clock基因在肾脏疾病中的作用，发现二者缺失均可加重CKD和糖尿病肾病中的纤维化、炎症及代谢稳态紊乱。然而，其他核心时钟基因（特别是Crys、Pers、Nr1d1、Nr1d2和Rors）在肾脏中的昼夜节律改变及其对CKD病理生理的影响仍不清楚。此外，钠-葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2）抑制剂已被确立为CKD的有效治疗策略，且已有研究表明达格列净的给药时间影响其改善糖代谢的效率，提示其具有时辰治疗潜力。基于上述背景，研究人员开展了本研究，旨在系统揭示CKD中肾脏昼夜节律转录组的重塑特征，并探索达格列净对肾脏核心时钟基因的潜在影响。该论文发表在《Renal Failure》。

二、主要技术方法

研究人员采用腺嘌呤饮食诱导CKD小鼠模型（C57BL/6J雄性小鼠，对照组喂食AIN93G饮食，CKD组喂食含0.25%腺嘌呤的相同饮食，每组18只），在六个时间点（ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20）采集肾脏组织，每时间点每组3只小鼠，进行四小时间隔的时间序列RNA测序。使用JTK_CYCLE算法（R语言MetaCycle包）识别节律性基因，以q值<0.2为节律性判定标准，并通过Cosinor分析确定节律参数（中值、振幅和峰相位）。差异表达基因（DEGs）以绝对倍数变化>2且校正q值<0.05为阈值。随后进行基因集富集分析（GSEA）、基因本体（GO）和KEGG富集分析，利用STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，通过MCODE和CytoHubba筛选枢纽基因。此外，还进行了定量实时PCR和蛋白质印迹验证，以及苏木精-伊红（H&E）染色、天狼星红染色和F4/80免疫组织化学染色评估肾脏病理改变。达格列净治疗实验中，小鼠分为对照组（CTRL）、腺嘌呤+溶媒组（AD_Veh）和腺嘌呤+达格列净组（AD_Dapa），每组18只。

三、研究结果

1. 1.
   CKD小鼠中昼夜节律谱被重编程

通过时间序列转录组测序和JTK_CYCLE分析，对照组检测到20,116个基因，CKD组检测到21,479个基因，两组共有19,329个基因。对照组有1,365个基因呈节律性表达，CKD组有2,783个基因呈节律性表达，其中261个基因在两组中均具节律性。对照组节律基因主要围绕ZT0达峰，p53信号通路和核糖体生物发生等通路在静息期显著富集；CKD组节律基因主要围绕ZT12达峰，代谢通路在ZT8富集，细胞生长与死亡及免疫系统相关通路在ZT12富集。两组共有节律基因的相位分布存在差异，且CKD组相对振幅高于对照组。

1. 2.
   CKD小鼠肾脏核心时钟基因表达被破坏

将六个ZT点的表达水平合并比较，CKD组中Cry1、Per1、Bhlhe40和Bhlhe41显著上调，Hlf表达下调。许多核心时钟基因（如Bmal1、Cry2、Per1和Nr1d2）在对照组中呈节律性表达，但在CKD中节律性被破坏；Bhlhe41仅在CKD组获得节律性。Cry1、Per2、Per3、Nr1d1、Bhlhe40和Hlf在两组中均具节律性，但其节律参数在CKD中显著改变，包括中值差异、峰相位提前及相对振幅降低。

1. 3.
   CKD中节律紊乱基因的生物学功能

根据节律模式将基因分为四类：两组均无节律（NR-NR）、仅对照组有节律（R-NR）、仅CKD组有节律（NR-R）及两组均有节律（R-R）。NR-R占64.9%（2,522个基因），R-NR占28.4%（1,104个基因），R-R占6.7%（261个基因），NR-R是CKD中昼夜节律紊乱的主要类型。GSEA分析显示，NR-R基因中炎症、结构完整性和细胞周期相关生物学过程被激活，而氨基酸、脂质和丙酮酸代谢相关过程被抑制；R-NR基因中细胞因子-细胞因子受体相互作用和p53信号通路高度激活，谷胱甘肽代谢显著抑制；R-R基因特异性富集于磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路。

1. 4.
   CKD中免疫和炎症相关通路的昼夜节律失调

对NR-R组中上调的DEGs进行KEGG富集分析，发现富集于多种免疫和炎症相关通路，包括激活蛋白激酶信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路和IL-17信号通路。免疫和炎症相关基因的表达相位聚集于ZT12–16。PPI分析鉴定出前10个枢纽基因，包括Tgfb1、Ccl2、Myd88、Spp1、Csf1、Nfkb1、Fos、Il33、Vcl和Ngf。Tgfb1、Ccl2、Csf1和Fos的节律性表达均在ZT12–16达峰。F4/80免疫组化染色显示，CKD小鼠ZT16时肾脏巨噬细胞浸润显著高于ZT0，与转录本达峰时间一致。通过灌胃给予腺嘌呤排除夜间进食习惯的混杂影响后，相关基因的节律性表达模式保持一致。

1. 5.
   CKD小鼠中关键代谢相关通路获得节律性

KEGG分析显示，NR-R组中下调的DEGs显著富集于三大营养素（碳水化合物、脂质和氨基酸）代谢及能量代谢通路（如三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化）。这些通路相关基因的相位分布跨越ZT0–ZT14，在ZT8–ZT10出现显著峰值。氨基酸代谢相关基因（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、赖氨酸和β-丙氨酸代谢）在CKD中下调并获得节律性。关键糖酵解基因（Pfkm、Pgk1和Pgam1）表达下调，丙酮酸脱氢酶激酶关键组分Pdhx表达降低，限制了丙酮酸进入TCA循环。脂肪酸转运和降解/氧化通路关键组分（Fabp3、Acsl3、Acox2、Acat1、Acat2和Hadha）表达显著紊乱。TCA循环中Idh2、Suclg2、Dlst、Sdha、Fh1和Mdh1被协同抑制并获得节律性表达。呼吸链复合物和ATP合酶机制的关键亚基编码基因表达同样受到影响。

1. 6.
   CKD中大量昼夜节律紊乱基因是核心时钟基因的直接转录靶标

从基因转录调控数据库提取核心时钟基因的转录因子-靶基因对，与NR-R组中免疫炎症相关DEGs和代谢相关DEGs取交集。结果显示，NR1D1的靶基因与基因集重叠最多，其次为BMAL1和CLOCK。将昼夜节律紊乱基因集（NR-R、R-NR和R-R）中的免疫炎症相关和代谢相关DEGs与靶基因集取交集后，同样发现NR1D1、BMAL1和CLOCK依次贡献了最多的靶基因数量。

1. 7.
   达格列净恢复CKD小鼠肾脏时钟基因的异常表达

与未治疗的CKD小鼠相比，达格列净治疗的小鼠体重增加，血尿素氮和血清肌酐水平降低，白蛋白尿减少，肾小管扩张和纤维化减轻。基于表1结果，研究人员重点评估达格列净对NR1D1和BMAL1的影响。在ZT8和ZT16，CKD小鼠与对照组之间BMAL1水平无显著差异；但ZT8时CKD小鼠p-BMAL1水平显著升高，NR1D1水平降低。达格列净治疗显著逆转了这些异常改变，使p-BMAL1和NR1D1水平恢复至生理基线水平。ZT16时观察到类似效应。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究揭示了CKD中肾脏昼夜节律的整体重编程。除Bmal1和Clock外，Cry2、Per1和Nr1d2在CKD中失去节律性，Bhlhe41获得振荡模式，而维持节律性的基因（Cry1、Per2、Per3、Nr1d1、Bhlhe40和Hlf）在中值、相位或振幅方面发生改变。免疫和炎症反应在CKD中受失调的昼夜节律控制，NR1D1和NR1D2是巨噬细胞中时钟与免疫之间的关键节点。代谢方面，线粒体呼吸相关通路（TCA循环和氧化磷酸化）的昼夜节律调控在CKD中可能被破坏。达格列净恢复NR1D1和p-BMAL1的平衡，提示其可能通过靶向昼夜节律在非高血糖CKD中发挥保护作用。研究局限性包括：未区分肾脏不同细胞类型的昼夜节律差异、局限于转录组水平、腺嘌呤诱导CKD模型与人类CKD病因存在差异、达格列净为预防性给药而非治疗性给药、仅纳入雄性小鼠。

研究结论：本研究发现CKD中昼夜节律谱被重编程，免疫-炎症和代谢过程的昼夜节律在CKD中失调，达格列净对CKD的保护作用可能与其恢复这些昼夜节律有关。