从土壤中分离出的一种甲基营养菌——Methylobacillus glycogenes的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of a methylotroph, Methylobacillus glycogenes, isolated from soil

　　

摘要

甲醇是一种可持续的、低成本的原料，可由二氧化碳（CO₂）或非食品生物质制造。我们报告了来自土壤的专性甲基营养菌 Methylobacillus glycogenes 菌株 PKM581 的完整基因组序列。该基因组包含一条环状染色体，长度为 3,397,625 个碱基对（bp）。

公告

甲醇可以由二氧化碳（CO₂）或非食品生物质合成，是一种低成本的 C1 碳源（1）。Methylobacillus glycogenes 是一种革兰氏阴性专性甲基营养菌，能够利用甲醇生成氨基酸（2，3）。PKM581 菌株是从日本大阪地表下 5 厘米处的土壤中分离得到的（坐标：34.7523°N, 135.4963°E）。将 1 克土壤悬浮在 25 毫升磷酸盐缓冲盐水中，在 25°C 和 150 转/分钟（rpm）的条件下培养 24 小时。之后以 1,000 转/分钟的速度离心 1 分钟，向上清液中添加甘油至浓度为 10%（体积比），并将得到的甘油储存于 -80°C。取 240 微升的甘油样品接种到含有 1%（体积比）营养液的 M9 最小培养基中，在 25°C 和 150 转/分钟条件下培养 7 天。随后将 10 微升的菌液转移到含有 0.4%（体积比）甲醇的 190 微升 M9 最小培养基中，置于 96 孔微孔板中培养 7 天。之后每周重复一次这种转移操作，共进行 12 次。最后通过三轮连续的单菌落分离，从甘油储存液中获得了 PKM581 菌株。

为了进行测序，PKM581 菌株在含有 0.4% 甲醇的 M9 最小培养基中，于 30°C 和 180 转/分钟条件下培养 48 小时。按照制造商的说明，使用 Monarch HMW DNA 提取试剂盒（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）提取基因组 DNA，并用同一提取的 DNA 制备了两份测序文库。测序工作由北京基因组研究所（BGI，中国深圳）完成。对于 DNBSEQ 测序，使用 Covaris LE220 仪器（Covaris，美国马萨诸塞州）将 1 微克的 DNA 切片至 200–400 bp 的长度，利用 MGIEasy Universal DNA 文库制备试剂盒进行预处理，然后在中国深圳的 DNBSEQ-G400 测序仪上完成测序（MGI Tech Co., Ltd.）。SOAPnuke v1.5.6 软件（参数设置：-l 20 -q 40% -n 0.1% -d）（4）共获得了 8,738,130 条读段，总长度为 1,252 兆碱基对（Mb）。对于 Cyclone 测序，直接使用未经片段化和尺寸选择的文库，在 WuTong 测序芯片（BGI；H930-000001-00）上的 CycloneSEQ G100-ER 仪器上进行测序。碱基识别、条形码解复用和数据修剪使用 wt_basic_v1.5.12 软件完成；质量低于 7 的读段被自动剔除，长度小于 1,000 bp 的读段也被排除。最终处理后的数据集包含 104,426 条读段，总长度为 1,422 兆碱基对（N50 值为 26,054）。

长读段使用 Canu v2.2 软件（设置：useGrid = 0 和 corOvlMemory = 4）进行校正和组装（5）。通过测序公司的组装工作流程中的序列循环判断来评估染色体的环状性。使用 GATK v3.4-0 软件（参数设置：-stand_call_conf 20.0, -stand_emit_conf 20.0, -allowPotentiallyMisencodedQuals）（6）对 DNBSEQ 测序得到的数据中的单碱基错误进行校正。最终确定染色体的方向，使其 1 号核苷酸对应于 dnaA 基因的起始密码子。使用 DFAST v1.2.0 软件和默认参数进行注释（7）。DNBSEQ 和 Cyclone 测序的覆盖率分别为 368× 和 418×。完成后的基因组是一条环状染色体，长度为 3,397,625 个碱基对，G+C 含量为 53.43%，预测有 3,116 个基因。

致谢

概念提出：T.M.；方法设计：T.M.；数据分析：T.M. 和 S.N.；实验研究：T.M. 和 S.N.；项目监督：T.M.；初稿撰写：T.M. 和 S.N.；审稿与编辑：T.M.；资金申请：T.M.；项目管理工作：T.M.