内布拉斯加盐沼富集样本的全基因组分析揭示两个新紫硫细菌物种

《Microbiology Resource Announcements》：New purple sulfur bacteria genomes from Nebraska salt marsh enrichments

　　

摘要

对来自内布拉斯加盐沼温罗茨基柱富集的样本进行了两个基因组的测序。全基因组系统发育分析和平均核苷酸一致性（ANI）比较表明，这两个基因组属于此前尚未描述的紫硫细菌物种，即Halochromatium（盐嗜色菌属）和Ectothiorhodospira marina（海洋外硫红螺菌）。

公告

内布拉斯加盐沼是一种罕见的内陆生态系统，由含盐的地下水补给，从而形成了独特的植物、昆虫和微生物多样性（1–4）。过去几年中，通过季节性宏基因组分析，已鉴定出若干独特的细菌物种（3，4）。然而，其中大多数尚未能在实验室中培养。我们现在通过在温罗茨基柱中对盐沼微生物进行富集，以鉴定和分离更多独特的光合物种。该温罗茨基柱（10厘米×4厘米）被放置在窗前的日光下，共放置4周。用于温罗茨基柱的样本材料取自以下地点：北纬40°52′54.42″，西经96°39′35.82″。使用100毫升无菌瓶采集样本，并在4°C下过夜保存，直到次日组装温罗茨基柱并将其置于25°C光照条件下。

经过4周的25°C光照培养，温罗茨基柱在约2厘米深度处出现了一条深红色的色带，并通过缓慢吸液从柱壁附近吸取了1毫升污泥。使用GeneJET DNA纯化试剂盒（Thermo Scientific）对此污泥进行基因组DNA提取。所得DNA浓度为68.3 ng/μL，A260/280值为1.85。使用Illumina DNA文库制备试剂盒制备测序文库，并采用Illumina MiniSeq测序仪对500 μL浓度为1.8 pM的文库进行测序。双端测序（2×150 bp）生成了2,679,692条测序读段，总数据量为399.3 Mbps。使用FASTQC（v1.0.0）对读段进行质量控制，k-mer大小为5，并针对默认污染列表对过度富集序列进行污染过滤。使用BaseSpace（Illumina）中的FASTQ Toolkit（v2.2.6）去除Illumina接头序列。使用BV-BRC中的宏基因组分箱功能组装基因组（5，6），该功能使用MetaSPAdes（v3.12.0）（7）。最终获得两个质量良好的细菌基因组：3,584,162 bp（GC含量63.7%）（NSM3_A）和3,548,302 bp（GC含量62.1%）（NSM3_B）。基因组特征汇总于表1中。根据CheckM（v1.1.6）（8）评估，最终基因组的完整性均超过99%。作为CheckM一部分的EvalG基因组质量分析显示，NSM3_A的潜在污染率低于2%，NSM3_B的潜在污染率低于4%。基因组注释由NCBI PGAP（v6.6）（9）完成。除另有说明外，所有软件均使用默认参数。

表1

表1 与两个新测序菌株相关的已测序Halochromatium物种和Ectothiorhodospira物种的基因组特征概览^a

物种	大小（Mb）	GC%	Contigs数	覆盖度（×）	N50	CDS	tRNAs	ANI	参考文献	GenBank登录号
Ectothiorhodospira sp. NSM3	3.6	62.1	162	111	62,990	3,419	43	–b	本文	JCAQHZ000000000
Ectothiorhodospira marina DSM 241 [T]	3.2	62.3	41	378	143,237	3,059	44	97	（10）	FOAA00000000
Ectothiorhodospira haloalkaliphila 9902	3.7	62.7	243	106	157,842	3,602	44	86.6	（11）	JAJNQR000000000
Ectothiorhodospira mobilis DSM 237 [T]	2.8	68.3	119	539	77,281	2,714	44	75.7	（10）	NRSK01000000
Halochromatium sp. NSM3	3.6	63.7	103	112	78,675	3,540	44	–	本文	JCAQIA000000000
Halochromatium salexigens DSM 4395 [T]	3.8	63.7	100	61	66,939	3,831	46	89.2	（10）	NHSF00000000
Halochromatium roseum DSM 18859 [T]	5.2	62	88	50	143,744	5,208	44	80.7	（10）	NHSH01000000
Halochromatium glycolicum DSM 11080 [T]	5.3	64.6	147	75	84,551	5,291	45	78.6	（10）	NRSJ00000000

^a

灰色底纹标示的是新测序的基因组。平均核苷酸一致性（ANI）百分比是基于与菌株NSM3-A和NSM3-B之间的双向ANIb值，使用JSpecies计算得出。

^b

–，ANI计算的参考基因组。

JSpecies（v4.1.1）（12）的ANI百分比比较结果显示，菌株NSM3_A与各Halochromatium物种的ANI值范围为89.2%至78.6%（表1），而菌株NSM3_B与Ectothiorhodospira marina的一致性高达97.0%。使用RAxML（13，14）在NCBI GenBank中比较两个新基因组与已知的Ectothiorhodospira和Halochromatium近缘物种的系统发育关系，结果显示Halochromatium salexigens DSM 4395是基因组NSM3-A的近缘种，而Ectothiorhodospira marina DSM 241是NSM3-B的近缘种（图1）。菌株NSM3-B可能是Ectothiorhodospira marina的一个新菌株；然而，所有Halochromatium物种的ANI值远低于物种划分界限（95%），表明菌株NSM3-A可能属于一个新物种。正式的进一步分离和生理特征表征实验正在进行中，以正式提议新物种。有趣的是，BV-BRC中的蛋白质组比较分析显示，Halochromatium NSM3-A比其他Halochromatium物种多含有116个独特的PGFams，并且是唯一含有氢化酶-4操纵子的物种。该操纵子被认为在厌氧能量代谢中起关键作用，通过催化甲酸分解为二氧化碳和氢气来实现，尤其适用于在能量胁迫和极端pH等恶劣条件下生存（15，16）。

图1

图1 Halochromatium NSM3-A和Ectothiorhodospira NSM3-B全基因组与各自近缘种比较的系统发育树。该系统发育树使用BV-BRC中的密码子树方法生成（7），该方法以PGFams作为同源性基团，使用RAxML（v8）分析141个比对蛋白和单拷贝基因编码DNA（13，14）。系统发育树的支持值由RAxML"快速Bootstrap"选项进行100轮获得。树采用中点 rooting，并使用iTOL进行树的可视化（17）。具有新基因组的物种以红色标示，分类科名以蓝色和绿色标示。

致谢

本研究由Bellevue大学科学应用研究威尔逊增强基金资助。