《Fish & Shellfish Immunology》：Eriocheir sinensis 14-3-3ζ regulates hemocyte phagocytosis, apoptosis and antimicrobial peptide expression during
Spiroplasma eriocheiris infection
编辑推荐：
•E. sinensis miR-2309直接靶向并抑制Es14-3-3ζ。•敲低Es14-3-3ζ降低了吞噬作用并促进凋亡。•敲低Es14-3-3ζ下调了免疫相关基因和抗菌肽的产生。•Es14-3-3ζ促进S. eriocheiris的内化及向溶酶体的细胞内运输。引言Spi
- •
E. sinensis miR-2309直接靶向并抑制Es14-3-3ζ。
- •
敲低Es14-3-3ζ降低了吞噬作用并促进凋亡。
- •
敲低Es14-3-3ζ下调了免疫相关基因和抗菌肽的产生。
- •
Es14-3-3ζ促进S. eriocheiris的内化及向溶酶体的细胞内运输。
引言
Spiroplasma eriocheiris是中华绒螯蟹Eriocheir sinensis抖病(TD)的病原体。该病原体传染性极强，感染蟹的死亡率可达约100%（Wang等，2011）。S. eriocheiris呈螺旋结构，长约3-12 μm，直径100-200 nm（Bi等，2008）。S. eriocheiris主要通过鳃或体表侵入蟹体，随后在血细胞内感染和增殖，形成大型胞质包涵体。最终血细胞破裂，将病原体释放至血淋巴中，引起系统性感染（Wang等，2004）。因此，阐明蟹防御S. eriocheiris感染的免疫机制对于TD的防控和蟹养殖的可持续发展具有重要意义。
作为无脊椎动物，蟹缺乏适应性免疫，主要依赖固有免疫系统防御入侵的病原体。固有免疫应答通过体液免疫和细胞免疫两大途径介导（Bouallegui，2021）。体液免疫主要涉及免疫效应分子（包括抗菌肽和溶菌酶）的合成与分泌，通过破坏入侵病原体的膜完整性实现病原体杀灭。细胞免疫主要依赖于血细胞的核心活动，包括通过吞噬作用清除入侵的病原体，以及通过胞葬作用消除凋亡细胞和细胞碎片，从而维持体内稳态（Gordon，2016）。先前的研究也证实，E. sinensis可通过调节吞噬和凋亡来有效抵抗S. eriocheiris感染（Hou等，2017；Wang等，2022）。因此，全面了解固有免疫对于蟹养殖疾病防控至关重要。
14-3-3ζ是14-3-3蛋白家族的重要成员，参与多种生物过程，包括信号转导、细胞骨架重塑、细胞周期调控和凋亡（Berg等，2003；Schubert等，2015；Sluchanko和Gusev，2010；Yang等，2020）。14-3-3蛋白通过与细胞骨架相关蛋白相互作用来调节细胞吞噬作用。14-3-3ζ已证实与肌动蛋白切断蛋白cofilin相互作用，并阻止其去磷酸化，从而维持细胞骨架动力学（Gohla和Bokoch，2002）。进一步的证据表明，14-3-3ζ通过调节细胞骨架重组和细胞突起形成来间接调节吞噬活性（Ulvila等，2011）。抑制14-3-3显著降低了C6/36 HT细胞对大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的吞噬作用，伴随14-3-3蛋白与肌动蛋白在丝状伪足样结构中的共定位（Trujillo-Ocampo等，2017）。此外，14-3-3ζ通过多条信号通路介导凋亡。例如，显性负突变体14-3-3ζ的转染抑制了小鼠NIH3T3细胞的ERK信号通路并诱导凋亡（Xing等，2000）。相反，14-3-3ζ与促凋亡蛋白BAD结合并将其保留在细胞质中，发挥抗凋亡作用（Macha等，2010）。此外，14-3-3ζ的下调通过线粒体途径促进细胞色素c释放和caspase-3活化，使人类星形胶质细胞对凋亡更加敏感（Hashemi等，2018）。最近，14-3-3也被发现参与水生无脊椎动物的免疫应答。例如，Cherax quadricarinatus造血组织细胞中含14-3-3结构域的蛋白在白斑综合征病毒(WSSV)感染的早期和晚期阶段表达显著变化（Jeswin等，2016）。凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 14-3-3ε与LvRab11相互作用形成功能复合物，增强对WSSV感染的抵抗力（Boonyoung等，2021）。此外，罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii 14-3-3蛋白与太湖湖病毒的包膜蛋白VP23相互作用以增强抗病毒免疫（Pan等，2021）。综上，这些发现表明14-3-3在水生无脊椎动物对抗病原感染的免疫防御中起关键调节作用。
微小RNA(miRNAs)作为关键的调控分子，调控着多种生物功能，包括细胞增殖、发育、代谢、凋亡和固有免疫（Gong和Zhang，2021）。成熟miRNAs部分或完全与靶标mRNA的3'UTR中的互补序列结合，导致靶标转录本的翻译抑制或降解（He等，2015）。在人类鼻咽癌中，miR-597通过负向调节肿瘤抑制基因14-3-3σ的表达，促进上皮-间充质转化(EMT)、肿瘤细胞的迁移和侵袭（Xie等，2019）。此外，越来越多的研究记录了miRNAs在水生甲壳类动物固有免疫调控中不可或缺的作用。Marsupenaeus japonicus的miR-1靶向网格蛋白重链1(CLTC1)，抑制血细胞对E. coli的吞噬作用（Liu等，2014）。源自锯缘青蟹Scylla paramamosain的miR-137和miR-7847通过靶向凋亡诱导因子(AIF)负向调节凋亡（Gong等，2020）。在WSSV攻毒后，外泌体中miR-137和miR-7847的丰度显著下降，触发了血细胞凋亡并抑制了病毒增殖。宿主来源的miRNAs也通过直接靶向病原体基因来对抗病原体入侵，例如，M. japonicus miR-1000同时靶向病毒基因wsv191和wsv407以阻碍WSSV感染（Gong等，2018）。另一种虾miRNA，miR-12，协同靶向两个宿主基因（PTEN和BI-1）以及病毒wsv024，进而促进血细胞吞噬、凋亡和宿主抗病毒防御（Shu和Zhang，2017）。总体而言，miRNA依赖性调控吞噬和凋亡构成了水生甲壳类动物对抗病原体入侵的重要防御策略。S. eriocheiris是一种感染多种水生甲壳类动物的胞内病原体。因此，在miRNA水平探索宿主对S. eriocheiris的免疫应答具有重要的生物学意义。本研究采用miRNA靶向验证和dsRNA介导的基因沉默相结合的方法，表征了S. eriocheiris攻毒后Es14-3-3ζ的生物学功能及调控机制，为开发蟹抖病新型防控策略奠定理论基础。
章节摘要
实验动物与病原体
健康的E. sinensis（平均约25 g）购自江苏省宝应县一家养殖场，在实验前于28°C的标准化循环养殖设备（海升，上海）中驯化一周。实验前，随机选取10%的个体，通过PCR检测确认未感染S. eriocheiris。
病原体S. eriocheiris最初从抖病(TD)病蟹中分离，在30°C的R2培养基中培养至
miR-2309靶向Es14-3-3ζ抑制血细胞吞噬作用
为验证miR-2309是否直接靶向Es14-3-3ζ，分析了Es14-3-3ζ 3' UTR中的潜在结合位点（图1A）。随后构建了携带野生型(WT)或突变型(MT)靶序列的双荧光素酶报告质粒。与阴性对照组（miR-533-3p mimics）相比，miR-2309 mimics共表达显著抑制了HEK293T细胞中WT-3' UTR报告构建体的荧光素酶活性。然而，这种抑制效应被完全
讨论
微小RNA(miRNAs)是一类长度约为22 nt的内源性非编码RNA。它们与靶标mRNA的3'UTR结合，触发mRNA降解或翻译抑制（Bartel，2004）。越来越多的证据表明miRNAs通过转录后调控参与水生甲壳类动物的病原体感染。例如，miR-10c在凡纳滨对虾L. vannamei WSSV感染后鳃组织显著上调，通过直接靶向和
伦理声明
本研究遵循以下动物福利和/或报告指南：美国国立卫生研究院《实验动物饲养与使用指南》。本研究经南京师范大学实验动物管理与伦理委员会批准。（批准号：IACUC-2025082）
作者贡献声明
邓涵和马煜博：概念设计、数据整理、实验研究、方法学、可视化、初稿撰写。魏宾、王海博、姚宇和陆思宇：实验研究、方法学。毕柯然、顾伟和丛小艳：项目管理、资源提供。孟庆国：资金获取、监督、撰写-审阅与编辑。
致谢
本工作得到中国江苏省"JBGS"种业振兴项目（编号：JBGS [2021]031）和中国江苏省现代农业生产体系项目（资助号：JATS [2023]311）的资助。
邓涵|马煜博|魏宾|王海博|毕柯然|姚宇|陆思宇|顾伟|丛小艳|孟庆国
