噬菌体辅助连续进化酶用于非经典酪氨酸生物合成

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Phage-assisted continuous evolution of enzymes for noncanonical tyrosine biosynthesis

　　

遗传密码扩展可将全新的化学官能团引入核糖体合成的蛋白质中。在实践中，该方法可触及的官能团范围通常受限于非经典氨基酸（ncAA）的可获得性。直接在细胞内生产ncAA可以规避ncAA摄取效率低下或商业上无法获得的问题，但适用于此用途的酶仍然有限。体外进化研究已获得具有合成应用价值的“ncAA合成酶”，但这些酶是针对制备规模合成优化的，其活性往往无法很好地转化至细胞内的生物合成场景。因此，拓展专门用于细胞内ncAA生产的酶工程策略，将有利于遗传密码扩展的进一步应用。本研究采用噬菌体辅助非连续进化和连续进化，在大肠杆菌（Escherichia coli）中进化酶以改善非经典酪氨酸衍生物的合成。通过简单的连续传代，研究人员发现了可使酪氨酸酚裂解酶将昂贵ncAA——3-甲氧基酪氨酸的产量提高一倍的突变，并进一步进化出能够实现3-碘酪氨酸生物合成的变体，而亲本酶无法在细胞内完成该转化。此外，研究人员还进化了一种近期报道的酪氨酸合成酶，以改善3-卤代酪氨酸的生产，鉴定出即使在低底物浓度下仍表现出高活性的变体，这归因于KM约降低八倍。研究结果表明，噬菌体辅助进化可用于快速提升酶在细胞内生产ncAA的活性。

论文解读：噬菌体辅助连续进化酶用于非经典酪氨酸生物合成

一、研究背景与科学问题

自然界产生的蛋白质通常仅由20种经典氨基酸构成，这限制了蛋白质可实现的化学多样性与功能范围。遗传密码扩展（genetic code expansion）技术允许将带有定制化学官能团的非经典氨基酸（noncanonical amino acids, ncAAs）插入细胞合成的多肽和蛋白质中，最常用的方法依赖正交氨酰-tRNA合成酶（orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS）/tRNA对，将ncAA安装到重新编码的密码子（通常为UAG）上。尽管已报道超过500种ncAA的工程化aaRS/tRNA对，但ncAA的高昂成本及其跨细胞膜的低效转运构成了该技术可及性的主要障碍。原位生物合成和半合成策略——分别从内源代谢物或外源添加前体生产ncAA——通过降低成本并利用更易透膜的前体，有望缓解上述问题。然而，体外定向进化获得的ncAA合成酶通常在体外高底物浓度（>10 mM）和有机共溶剂条件下优化，其活性往往难以直接转化至细胞内生物合成场景。因此，亟需开发专门针对细胞内ncAA生产的酶工程策略。连续进化方法，如噬菌体辅助连续进化（phage-assisted continuous evolution, PACE），提供了比传统定向进化更快速、可扩展的替代方案。PACE能够以约10¹¹成员的文库规模快速探索序列空间，且由于进化过程的自动化，可执行远超传统方法的进化轮数。然而，PACE在小分子生物合成领域的应用仍相对不足，部分原因在于难以将目标小分子的产量与PACE选择标记——噬菌体蛋白pIII的产生相偶联。本研究旨在利用噬菌体辅助进化策略，快速优化两种催化C─C键形成的酶——酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol lyase, TPL）和酪氨酸合成酶（tyrosine synthase, TyrS），以实现非经典酪氨酸衍生物在细胞内的高效半合成。

二、主要技术方法

研究人员构建了将ncAA合成与pIII产生相偶联的选择系统：噬菌体携带编码ncAA合成酶的基因替代gIII，宿主细胞表达可识别目标ncAA的正交aaRS/tRNA对，以及含两个琥珀密码子的gIII*辅助质粒。只有当ncAA合成酶成功生产ncAA并被正交aaRS/tRNA对掺入pIII后，噬菌体才能产生有感染力的子代。研究采用了噬菌体辅助非连续进化（phage-assisted noncontinuous evolution, PANCE）和PACE两种模式，并结合MP6/MP4诱变质粒进行随机突变。此外，研究人员还构建了基于A169/L170/R171三位点饱和突变文库的噬菌体文库，以及通过降低aaRS核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）强度、增加gIII琥珀密码子数量等手段提高选择严格性。所有酶活性评估均通过GFP荧光报告系统完成，即ncAA产物被掺入含琥珀密码子的sfGFP中产生荧光信号。

三、研究结果

PACE选择系统的建立与验证。 研究人员首先使用SAM依赖性甲基转移酶MfnG验证选择系统。MfnG可将酪氨酸转化为O-甲基酪氨酸（OMeY）。携带MfnG的噬菌体在含MjOMeYRS/MjtRNA^mut和gIII**的宿主细胞上表现出约10,000倍的增殖活性，而失活突变H271P使噬菌体增殖下降超过10⁵倍，证明噬菌体适应性完全依赖于酶活性。在竞争实验中，即使野生型MfnG噬菌体以1:10,000的比例起始，也能在24小时内超越失活突变体。PACE还成功实现了H271P突变的完全回复，证实该选择策略可用于ncAA合成酶的进化。

酪氨酸酚裂解酶（TPL）的进化。 研究人员以Citrobacter freundii来源的CfTPL^M379V为起点，首先通过PANCE进化其利用2-甲氧基苯酚（2OMePh）生产3-甲氧基酪氨酸（3OMeY）的能力。经过10轮传代，所有分离的克隆均收敛于C179S突变，该突变单独即可使GFP信号提高两倍以上。随后，研究人员以2-碘苯酚（2IPh）为底物进化CfTPL^M379V，目标是获得亲本酶几乎无活性的3-碘酪氨酸（3IY）生产能力。经过含漂移传代和逐步提高选择严格性的PANCE，分离出的变体（如N2.2-1和N2.2-2）在500 μM 2IPh条件下产生超过亲本10倍的荧光信号，且质谱证实GFP中确实掺入了生物合成的3IY。结构分析显示，C179S位于活性位点附近，可能通过影响PLP辅因子的电子特性发挥作用；S378T紧邻M379，可能进一步扩展底物谱。值得注意的是，进化后的TPL变体在提高合成活性的同时，其降解活性也相应增强，提示TPL进化存在合成与降解之间的权衡。

酪氨酸合成酶（TyrS）的连续进化。 鉴于TPL的降解活性限制，研究人员转向TyrS——一种由色氨酸合酶TmTrpB-9D8*工程化而来的PLP依赖性C─C键形成酶，该酶不具有裂解酶活性。测试发现，最先进的TyrS6在细胞内几乎无活性，而TyrS4表现出中等活性。研究人员通过PANCE结合PACE对TyrS4进行进化，分别以2-溴苯酚（2BrPh）和2-碘苯酚（2IPh）为底物，获得变体P1-1和P2-1。两者共享G3S、A169V和Y181H三个突变，均显著改善了三种3-卤代酪氨酸（3ClY、3BrY、3IY）的生产能力。动力学分析显示，P1-1的K_M较TyrS4降低约两倍，P2-1则在k_cat和K_M两方面均有改善。

位点饱和文库的选择。 为更高效地探索适应度景观，研究人员构建了TyrS4 A169/L170/R171三位点饱和突变文库（理论规模约35,000个成员）。通过PANCE选择，仅10-11轮传代即鉴定出N6-1和N8-1等变体，其活性与P1-1和P2-1相当，且普遍富集A169V和L170W突变。这些变体的催化效率略高于P1-1和P2-1，主要归因于K_M的改善。

提高选择严格性获得高活性变体。 为在P2-1基础上进一步提升活性，研究人员通过降低aaRS的RBS强度并增加gIII的琥珀密码子数量来提高选择严格性。在PACE中，使用中等RBS（P3）和弱RBS（P4）的两个反应池最终分别收敛于变体P3-3和P4-1。P3-3在P1-1基础上新增A103T、L170W和L375V突变。动力学分析显示，P3-3的K_M较TyrS4降低约八倍（从336 μM降至44 μM），尽管k_cat降低约三倍。在低底物浓度下，P3-3的活性显著提升：使用10 μM 2XPh即可达到TyrS4在50倍底物浓度下的荧光水平。P3-3还能利用2OMePh生产3OMeY，活性与CfTPL^M379V相当。结构分析表明，P3-3的突变集中在COMM结构域和同源二聚体界面，可能通过重塑底物结合口袋或影响二聚体稳定性来改善酶活性。

四、讨论与结论

本研究将噬菌体辅助进化成功应用于三种酶的ncAA合成能力优化：SAM依赖性甲基转移酶MfnG、CfTPL^M379V和TyrS。TPL进化在两周内即获得显著激活的变体，不仅提高了昂贵ncAA 3OMeY的产量，还获得了对TPLs此前被认为无活性的2IPh底物的新活性。TyrS的进化则需要PANCE和PACE的组合，且通过位点饱和文库和降低aaRS表达的策略进一步提升了活性。最终变体P3-3的K_M降低约八倍，在极低底物浓度下即可高效合成3-卤代酪氨酸。值得注意的是，进化过程似乎倾向于优化K_M而非k_cat，这可能反映了体内选择策略的性质或目标酶的可进化性。该研究拓展了可通过低成本生物合成获得的ncAA范围，展示了噬菌体辅助进化选择系统对不同目标ncAA的模块化适用性，为遗传密码扩展技术在生物技术应用中的进一步实施以及未来细胞内ncAA生产酶的工程化奠定了基础。论文发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》。