牛奶与黑巧克力中分离所得蛋白质翻译后修饰的表征

《Food Chemistry》：Characterization of posttranslational protein modifications isolated from Milk and dark chocolate

　　

• •
  开发了一种从黑巧克力和牛奶巧克力中分离完整蛋白质组分的新型方案。
• •
  建立了一种针对巧克力蛋白质组分的新型酶解方案。
• •
  发现黑巧克力蛋白质的AGE修饰程度是牛奶巧克力蛋白质的两倍。
• •
  N⁶-甲酰赖氨酸是巧克力中主要的Maillard修饰产物。
• •
  巧克力是外源性AGEs摄入的重要来源。

引言

晚期糖基化终末产物（AGEs）是氨基酸化合物（主要是蛋白质）在与还原糖发生美拉德反应过程中形成的稳定修饰物。^{(Hodge, 1953; Luevano-Contreras & Chapman-Novakofski, 2010)} 这种变化尤其涉及赖氨酸和精氨酸等氨基酸，导致蛋白质生物质量和生物利用度降低，在加工食品中尤为明显。^{(Luevano-Contreras & Chapman-Novakofski, 2010; Mehta & Deeth, 2016)} 当美拉德修饰在体内发生时，AGEs与多种疾病和衰老过程密切相关。^{(Luevano-Contreras & Chapman-Novakofski, 2010; Nagaraj et al., 2012)} 此处，酶、载体蛋白或膜蛋白等功能性生物分子发生修饰，导致其生物功能或反应活性显著丧失，可能直接引发上述疾病。^{(Hamzal?o?lu & G?kmen, 2020; Nagaraj et al., 2012)} 例如，N⁶-羧甲基赖氨酸（CML）作为研究最广泛的AGEs之一，在正常人类晶状体中的浓度检测为888至5484 pmol/mg蛋白质，而白内障晶状体中则为2279至7703 pmol/mg蛋白质。此外，CML浓度与健康参与者的年龄直接相关（r = 0.780）。^{(Smuda et al., 2015)}

此外，关于日常饮食摄入的外源性AGEs对健康的影响和去向仍有持续讨论。^{(Luevano-Contreras & Chapman-Novakofski, 2010)} 一方面，吸收程度强烈依赖于所研究的AGEs结构。吡咯烷素（pyrraline）的吸收率约为60–80%，并直接导致血浆浓度升高，而其他AGEs的吸收率仅为30%。^{(Koschinsky et al., 1997; Nowotny et al., 2018)} 另一方面，AGEs在血液循环和排泄方面的机制也尚未被详细阐明。约50%摄入的吡咯烷素以与游离戊糖素（约60%）相似的方式经尿液排泄。^{(Luevano-Contreras & Chapman-Novakofski, 2010)} 然而，仅有2%的蛋白结合戊糖素经尿液排泄。^{(Nowotny et al., 2018)} Lima等人（2024）对AGE摄入对健康影响的矛盾报道进行了综述，总结认为，即使是超过人类和动物典型膳食水平的AGEs高剂量摄入，对健康生物标志物也没有显著影响。然而，AGEs的表征基于非常有限的谱系，因此缺乏计算通过人类饮食摄入的AGEs日总摄入量的大量数据。早期研究基于使用单克隆抗CML抗体的非特异性ELISA测定或荧光测量，^{(Luevano-Contreras & Chapman-Novakofski, 2010; Uribarri et al., 2015)} 因此文献中给出的日摄入量范围仅为9000至23,000 kU/天。^{(Goldberg et al., 2004; Nowotny et al., 2018; Uribarri et al., 2010)} 首个基于LC-MS/MS针对所有主要食品类别AGEs含量进行综合概述的特异性方法计算出每日摄入量为27.1 mg AGEs/天，其中21.7 mg/d以甲基乙二醛衍生的羟咪唑啉酮（MG-H）形式摄入。^{(Scheijen et al., 2018)} 在此背景下，检测到的黑巧克力总AGEs含量显著高于牛奶巧克力（7.82 vs. 2.60 mg/100 g）。尽管分析是在严格控制条件下进行的，但该研究仅限于酸性蛋白质水解，聚焦于三种AGEs（MG-H、CML、N⁶-羧乙基赖氨酸（CEL））。鉴于目前已知的大量酸不稳定AGEs，这表明实际的饮食AGE负荷必须远高于此。"酸不稳定"是指AGEs在标准酸性蛋白质水解条件（6 M HCl）下不稳定，例如N⁶-甲酰赖氨酸，而CML或CEL等则在这些条件下稳定。由于酸性蛋白质水解相比针对特定基质优化的复杂多步酶解方案更容易操作，因此研究重点通常局限于非常有限的主要酸稳定AGEs，如CML和CEL，并结合部分稳定的MG-H。从机理上理解，CML与Amadori产物的氧化裂解及与乙二醛的反应相关，而CEL和MG-H则分别与甲基乙二醛和赖氨酸及精氨酸相互作用有关。

一份最新关于巧克力中美拉德反应的研究采用了更具区分度的策略，包括二羰基化合物、Amadori产物和AGEs的分析。^{(Sundaresan et al., 2025)} AGEs测量基于酶解蛋白质水解，与上述三种AGEs的研究结果相反，黑巧克力vs.牛奶巧克力的数值显著降低（1.55 vs. 3.50 mg/100 g）。显然，这种差异必定源于蛋白质分离方法和水解类型的不同。总体而言，在复杂且高度加工的食品基质（如巧克力）中定量AGEs至今仍是最大的挑战。可可蛋白在巧克力制造过程中的发酵、烘焙和精炼过程中被修饰，因此巧克力的可提取蛋白含量据报道低于10%。^{(Zak & Keeney, 1976)} 此外，巧克力中的其他主要成分如脂肪（约40%）和糖（约50%）也需要在通过LC-MS/MS定量AGEs之前去除，进一步增加了复杂性。

鉴于2023年德国人均巧克力消耗量为13.6 kg/年^{(Statistisches Bundesamt [Destatis], 2024)}，本研究首次为牛奶巧克力和黑巧克力建立了定量且具代表性的巧克力蛋白分离方法（回收率98–102%）。经酸水解和酶水解后，可定量主要AGEs以及呋喃素（代表Amadori产物）和三种其他翻译后修饰，如N⁶-乙酰赖氨酸。样品制备过程中的蛋白质分级允许区分其中牛奶蛋白和可可蛋白的修饰程度。

章节摘要

化学品

除另有说明外，最高品质的化学品均购自Sigma-Aldrich（德国）和Carl Roth AG（德国）。AGEs参考标准品按先前报道的方法合成或购买。^{(Baldensperger et al., 2019; Glomb & Pfahler, 2001)} 不同品牌的巧克力样品购自当地杂货店（表1）。牛奶巧克力的可可含量为30至35%（中位数30%），黑巧克力为50–73%（中位数60%）。

蔗糖和乳糖定量、脂肪含量及脱脂程度

蔗糖和乳糖的定量

巧克力样品中蛋白质的提取

从巧克力等复杂且高度加工的食品基质中定量提取蛋白质是一项极具挑战性的任务。^{(Uribarri et al., 2015)} 如表1所示，测试的商业巧克力样品蛋白质含量均值分别为牛奶巧克力6.4%和黑巧克力7.9%，同时含有高达60%的糖和43%的脂肪。首先，经脱脂后基于Biemel等人（2001）零食产品的成熟方案所得结果不理想。

结论

包括CML、CEL、MG-H、CEA、N⁶-甲酰赖氨酸和吡咯烷素在内的所有AGEs总和在牛奶巧克力中为17.3 mg/100 g，而黑巧克力的总AGEs含量显著更高，为33.5 mg/100 g（图4）。按照人均13.6 kg/年（37 g/天）的巧克力消费量^{(Destatis, 2024)}，巧克力引起的日AGEs摄入总量可计算为6.4 mg/天或12.4 mg/天。因此，与Scheijen等人（2018）提出的总日摄入量（27.1 mg/d AGEs）相比，

CRediT作者贡献声明

Thomas Heymann：撰写——原稿、方法论、调查、形式化分析、数据整理、概念构思。Marcus A. Glomb：撰写——审稿与编辑、监督、资源、数据整理、概念构思。

未引用参考文献

Augusta Rolim Biasutti, Regina Vieira, Capobiango, Dias Medeiros Silva and Pinto Coelho Silvestre, 2007

Statistisches Bundesamt, 2024

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

Thomas Heymann | Marcus A. Glomb