《Food Research International》：Lysine analogue-driven adaptive evolution produces lysine-overproducing wine yeast strains
编辑推荐：
•适应性进化获得了赖氨酸过量生产的酿酒酵母菌株。•进化菌株在37°C下表现出改善的生长。•氨基酸和谷胱甘肽水平升高。•LYS21 V127F突变有助于AEC耐受性。引言葡萄汁中的氮素可用性是酿酒发酵进程的一个关键参数，因为它在多个层面发挥作用。它调节酵母生物量的形成，进而影响
• 适应性进化获得了赖氨酸过量生产的酿酒酵母菌株。
• 进化菌株在37°C下表现出改善的生长。
• 氨基酸和谷胱甘肽水平升高。
• LYS21 V127F突变有助于AEC耐受性。
引言 葡萄汁中的氮素可用性是酿酒发酵进程的一个关键参数，因为它在多个层面发挥作用。它调节酵母生物量的形成，进而影响发酵速率和发酵完成时间（Crépin等，2012；Gutiérrez等，2012；Su等，2019）。此外，氮源的分解代谢与中心碳代谢共同参与酿酒酵母中发酵风味前体的合成（Barbosa等，2012；Su等，2020）。葡萄汁含有多种酵母可利用氮（YAN）源，定义为可供酵母代谢的氨基酸（脯氨酸除外）和铵，包括氨基酸、铵、尿素、瓜氨酸、鸟氨酸和小肽等（Kevvai等，2016）。然而，这些氮源对酿酒发酵过程中酵母生长、发酵速率或香气产生的影响并不相同。氮源质量——以支持酵母生长和发酵活性的能力来衡量——主要在Saccharomyces cerevisiae （酿酒酵母 ）中得到评估（Godard等，2007；Gutiérrez等，2013），也在非Saccharomyces （出芽酵母属 ）物种中得到研究（Su等，2020），其中贫氮源（如色氨酸、酪氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸）与富氮源（如铵、谷氨酰胺或天冬酰胺）之间存在显著差异。
酵母优先利用能够最好支持生长的底物，这通过一种称为氮代谢物阻遏（NCR）的调控机制实现。该机制在多个层面运作，以防止在有优质氮源可用的情况下吸收较差的氮源（Crépin等，2012；Gutiérrez等，2012；Magasanik & Kaiser，2002）。然而，在优质氮源与早期吸收之间的假说相关性中，有一个显著的例外：赖氨酸。先前探索氮源吸收顺序的研究表明，赖氨酸实际上是S. cerevisiae （Crépin等，2012；Su等，2019）和非Saccharomyces （Rollero等，2018；Su等，2019）中被最早吸收的氨基酸。此外，酵母细胞从培养基中迅速获取赖氨酸的这一倾向与初始浓度无关（Crépin等，2012；Su等，2019）。与其他氨基酸不同，无论赖氨酸在培养基中的浓度如何，它都被迅速耗尽（Su等，2019）。这一结果出人意料，因为考虑到S. cerevisiae 无法以赖氨酸作为唯一氮源进行生长——该物种缺乏分解代谢此氨基酸以及合成其余蛋白原氨基酸的代谢机制。因此，正如先前研究所表明的那样，赖氨酸既不支持良好的生长，也不支持发酵活性（Su等，2019），应被视为S. cerevisiae 的一种贫氮源。因此，这一结果所提出的问题是：为什么无论赖氨酸的初始浓度如何，它都被从葡萄汁培养基中迅速耗尽，即便它不能被直接用于生物量生产或增强发酵活性。
Olin-Sandoval等人（2019）的研究可能对此问题提供一个解释，他们将赖氨酸代谢与抗氧化应激反应联系起来。细胞摄取胞外赖氨酸至比生长所需浓度高达一百倍的浓度。这种大量摄取在其他氨基酸中并未观察到，依赖于多胺途径，并触发氧化还原代谢的重编程。结果是，原本用于赖氨酸生物合成的NADPH被引导至谷胱甘肽代谢，导致谷胱甘肽浓度大幅升高、活性氧（ROS）水平降低和氧化应激耐受性增强（Olin-Sandoval等，2019）。另一个有趣的结果是赖氨酸代谢与酿酒发酵过程中二氧化硫（SO2 ）抗性之间的联系（Lage等，2019）。研究表明，在葡萄汁中补充赖氨酸可以缓解这种在酿酒中广泛使用的防腐剂对S. cerevisiae 的毒性效应。Lage等人（2019）的解释是，SO2 诱导的应激会导致酵母胞内赖氨酸耗竭，而补充赖氨酸可以补充该氨基酸的胞内短缺，从而增强酵母在酿酒过程中的耐受性。尽管如此，证明赖氨酸补充可以缓解SO2 对S. cerevisiae 的毒性效应仍是一项重要发现，因为酿酒师可以轻松利用这一特性来改善酿酒过程中酵母菌株的表现，尤其是那些对SO2 防腐作用更为敏感的菌株。Novo等人（2013）进一步强调了酿酒中赖氨酸补充的必要性，因为他们发现某些天然葡萄汁中该氨基酸供应不足，这对酿酒发酵过程中酵母的适应性产生了负面影响。
所有这些证据都支持获取关于酿酒酵母中赖氨酸代谢新见解的重要性。为此，我们通过适应性实验室进化（ALE）获得了几株在有毒赖氨酸类似物S-氨基乙半胱氨酸（AEC）存在下胞内赖氨酸过量生产的突变菌株。我们表征了这些进化菌株在抗氧化抗性、发酵性能、与胞内谷胱甘肽升高相关性等方面的表型。我们还对这些过度积累的菌株进行了基因分型，通过分析它们与亲本酿酒菌株相比的全基因组来检测并验证导致赖氨酸过量生产的基因组变化。总体实验设计在图1中进行了示意图展示。这些过度积累菌株可以作为活性干酵母（ADY）更适合酿酒过程；然而，它们的工业生产也可以以非活性干酵母（IDY）的形式用于酿酒发酵过程中酵母的营养补充。IDY是一种由酵母菌株在富糖有氧培养基中培养并经热或酶灭活处理制成的产品，其中富含氨基酸或谷胱甘肽等不同代谢物（López-Solís等，2016）。在酿酒学中，使用这些IDY产品来改善技术工艺或葡萄酒的感官特征是一种常见的做法。然而，迄今为止，还没有可供用于改善酿酒酵母在酿酒发酵苛刻条件下应激抗性的赖氨酸富集IDY产品。
章节摘要 菌株和培养基 本研究中使用的菌株为工业菌株P14、P23、P6和P4，均属于Lallemand公司（加拿大），以及实验室菌株BY4741和BY4743。ALE实验在P14工业菌株中进行。本研究中使用的菌株完整列表见补充表S1。
酵母菌株在合成定义（SD）培养基中培养（0.17%（w /v ）酵母氮源基础培养基，0.5%（w /v ）硫酸铵，2%（w /v ）葡萄糖）。对于ALE实验，使用含0.1%的改良SD培养基
通过适应性实验室进化（ALE）产生赖氨酸过度积累菌株 传统的改良策略一直用于获得赖氨酸过量生产的酵母菌株，涉及筛选对有毒赖氨酸类似物S-氨基乙半胱氨酸（AEC）具有抗性的突变体（Feller等，1999；Garrigós等，2024；Gasent-Ramírez & Benítez，1997）。在本研究中，我们使用ALE方法开发了非重组的Saccharomyces cerevisiae 酿酒菌株，使其赖氨酸过度积累。本研究选择的菌株为P14，该菌株由
结论 赖氨酸是人类必需的氨基酸，可保护多种生物免受多种应激，如冷冻、氧化以及高温干燥的组合（Isogai等，2021）。工业生产的赖氨酸广泛用作饲料添加剂，以确保牲畜获得充足的赖氨酸，促进良好生长、提高肉质并增强动物免疫力。此外，我们证实了赖氨酸在酿酒发酵过程中对酵母代谢的一个意想不到的作用（Su等，2019），
CRediT作者贡献声明 Sara Mu?iz-Calvo： 撰写——初稿，可视化，方法学，调查研究。Elena Valera-García： 方法学，调查研究。Judit Pardo： 方法学。María Vázquez： 调查研究，形式化分析。Andrés Planells-Cárcel： 验证，方法学。Javier Alonso-del-Real： 数据整理。Ying Su： 方法学，调查研究。José María Heras： 项目管理，资金获取。Anne Julien： 可视化，项目管理，资金获取。Estéfani García-Rios： 撰写
资金支持 本工作由Lallemand Bio, S.L.以及MCIN/AEI/
10.13039/501100011033 资助，项目编号PID2022-142748OB-I00，授予J.M.G.。E.G.-R.由
瓦伦西亚自治区政府 GenT计划CIDEIG/2022/028号资助支持。由MCIU/AEI/
10.13039/501100011033 资助的Severo Ochoa卓越中心认证CEX 2021–001189-S也得到了充分感谢。我们感谢中国科技部高端外国专家引进计划（G2022172024L）和国家
利益冲突声明 作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能对本论文所报告的工作产生影响的冲突。
Sara Mu?iz-Calvo|Elena Valera-García|Judit Pardo|María Vázquez|Andrés Planells-Cárcel|Javier Alonso-del-Real|Ying Su|José María Heras|Anne Julien|Estéfani García-Rios|José M. Guillamón
