胶原蛋白的定量结构变化决定了discoidin结构域受体2的结合效率以及CAL-27细胞之间的黏附行为

《International Journal of Biological Macromolecules》：Quantitative structural alterations of collagen dictate discoidin domain receptor 2 binding efficacy and CAL-27 cell adhesion behaviors

　　

摘要

胶原蛋白特异性地与discoidin结构域受体2（DDR2）结合，以调节细胞行为，如黏附和扩散。尽管其分子结构极易受到物理化学修饰的影响，但这些变化对DDR2结合及下游细胞反应的定量影响仍知之甚少。在本研究中，系统地探讨了包括冷冻研磨、加热和辐照在内的物理处理对牛跟腱胶原蛋白结构完整性的影响，以及其对DDR2结合能力的影响。使用圆二色光谱和SDS-PAGE技术量化了结构参数，并以CAL27鳞状细胞癌细胞作为细胞模型。胶原蛋白与DDR2的亲和力与三螺旋结构的完整性呈指数正相关（R2 = 0.92），与分子片段化程度呈指数负相关（R2 = 0.96）。结合能力也与CAL27细胞的黏附效率呈强线性相关（R2 = 0.91）。逐渐的结构降解显著降低了细胞黏附能力，限制了细胞扩散，并下调了表面DDR2的表达。这项研究为胶原蛋白结构参数与DDR2结合之间的关系提供了定量框架，并建立了指数相关模型。这些见解可能有助于合理设计先进的胶原蛋白生物材料和靶向受体治疗药物。

引言

胶原蛋白是脊椎动物细胞外基质（ECM）中最丰富的结构蛋白，不仅为结缔组织提供必要的生物力学支持，还作为调节多种细胞行为（包括黏附、迁移、增殖和分化）的关键生化信号[1][2][3]。这些生物学功能主要通过胶原蛋白天然的三螺旋构象与细胞表面受体之间的特异性相互作用来实现。重要的是，在生理和病理微环境中，胶原蛋白会因机械力、蛋白酶和温度波动而持续发生结构重塑[4][5]。这种动态演变包括部分螺旋解旋、酶切和纤维逐步解体，凸显了定量阐明结构变化如何调节受体介导的细胞信号传导的必要性。

在胶原蛋白受体中，discoidin结构域受体2（DDR2）作为受体酪氨酸激酶（RTK）家族的成员，因其能够将细胞外胶原蛋白信号转化为细胞内生化反应而受到广泛关注[6][7]。从结构上看，DDR2的细胞外discoidin结构域特异性识别并结合纤维状胶原蛋白的三螺旋构象，这一相互作用会触发受体二聚化及随后细胞内激酶域的自磷酸化，从而激活下游信号通路[8]。在生理条件下，DDR2介导的信号传导对维持ECM稳态和组织修复至关重要。相反，在肿瘤微环境中，DDR2的异常激活被认为会通过诱导上皮-间充质转化（EMT）和上调基质金属蛋白酶（MMPs）来促进癌症侵袭和转移[9][10]。胶原蛋白-DDR2信号通路在组织再生和肿瘤进展中的双重作用使其分子机制的深入理解具有重要的科学意义和临床价值。

在阐明控制胶原蛋白-DDR2识别的结构决定因素方面已经取得了实质性进展。晶体学和生化研究确定了纤维状胶原蛋白中保守的GVMGFO六肽基序作为主要的DDR2结合表位，并证明这种高亲和力相互作用严格依赖于三螺旋结构的完整性[8][11]。冷冻研磨、热处理和辐照已被证明会破坏胶原蛋白的三螺旋结构并诱导肽链断裂[12][13][14]，这可能减弱DDR2的结合及后续的细胞反应[15][16][17]。此外，最近的研究表明，即使将含有相应结合序列的肽片段纳入重组蛋白结构中并保持与受体的物理结合，如果没有连续的三螺旋大分子框架，它们也无法引发受体自磷酸化或激活下游信号通路[18][19]。这些发现共同表明，三螺旋结构不仅是表位呈现的结构支架，还是受体激活和信号传导所必需的功能性要素。

尽管有这些发现，但关键的知识空白仍然存在。目前对DDR2信号传导结构依赖性的理解主要基于天然胶原蛋白与完全变性的胶原蛋白之间的二元比较，这种实验范式忽略了体内胶原蛋白重塑的连续性和异质性。在复杂的生物微环境中，胶原蛋白很少处于完全完整或完全变性的状态；相反，它经历不同程度的构象转变，产生具有不同三螺旋完整性的结构中间体[20][21][22][23]。这些中间状态对DDR2结合亲和力、受体激活动力学和下游细胞反应的定量影响尚未得到充分探索。换句话说，尚未建立系统的结构-活性关系（QSAR），以将胶原蛋白分子结构的连续演变与受体水平的结合参数和细胞水平的功能结果联系起来。

在此，我们系统地研究了胶原蛋白结构逐渐降解与DDR2介导的细胞反应之间的定量相关性。通过控制变性和蛋白酶处理生成一系列胶原蛋白构象状态，并结合分子水平的结构表征、受体结合分析和细胞功能检测，我们建立了一个QSAR框架，将胶原蛋白的三螺旋完整性与DDR2结合效率和下游细胞行为联系起来。这项工作不仅推进了对动态微环境下胶原蛋白-受体信号传导机制的理解，还为组织工程中的胶原蛋白基生物材料提供了合理设计原理，并为针对DDR2轴的治疗策略提供了新的视角。

章节片段

主要材料与试剂

天然牛跟腱胶原蛋白购自Trauer Bio-tech（中国广州）。人类舌鳞状细胞癌细胞系（CAL-27）由武汉大学口腔医院提供。重组DDR2蛋白购自Sino Biological（中国北京）。所有细胞培养试剂，包括Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶和细胞冻存溶液，均来自Solarbio（北京）。

物理处理会以时间依赖的方式破坏胶原蛋白的二级结构

图1A₁、B₁和C₁显示了经过冷冻研磨（CCOL）、加热（HCOL）和辐照（ICOL）处理的胶原蛋白的CD光谱。天然牛跟腱胶原蛋白在215至230 nm处显示出一个特征性的弱正带，在190至200 nm处显示出一个明显的负带，初始正负峰强度比为0.144。这三种处理均导致CD带随时间减弱，同时Rpn值升高。

结论

总之，本研究定量描述了冷冻研磨、热处理和辐照如何破坏胶原蛋白的结构完整性，从而调节其与DDR2受体的特异性结合。完整的三螺旋构象对DDR2识别至关重要。结合效率遵循非线性模式，与三螺旋结构的完整性呈正相关，与分子片段化程度呈负相关。这些分子相互作用进而影响...

作者贡献声明

侯园静：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。王飞：撰写 – 原始草稿，正式分析，数据管理。韩青秋：撰写 – 原始草稿，正式分析，数据管理。范德生：方法学，实验研究。张俊濤：验证，方法学，正式分析。魏本梅：验证，方法学，正式分析。 Kou慧志：资源获取，概念构思。王海波：资源获取，概念构思。

利益冲突声明

本研究不存在需要声明的利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22608436、22178277、22378320）、湖北省教育厅青年人才计划（编号：Q20241710）以及武汉理工大学研究启动资金（编号：53210052328）的支持。

侯园静|王飞|韩青秋|范德生|张俊濤|魏本梅| Kou慧志|王海波