《International Journal of Biological Macromolecules》：Insertion of CG repeats and 3′ terminus overhangs drive B-to-Z transition: A case study with NF-κB bearing DNA nanostructures
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•短CG重复序列的插入可诱导自组装结构中的B到Z DNA构象转变。•环区含有3T的bDNA结构对B-Z转变的敏感性高于5T环区结构。•悬突序列从5′端向3′端方向的转移可刺激bDNA中的B-Z转变。•含有3′悬突的NF-kB序列被发现对B-Z转变敏感。•环区含有3T且具有3′
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短CG重复序列的插入可诱导自组装结构中的B到Z DNA构象转变。
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环区含有3T的bDNA结构对B-Z转变的敏感性高于5T环区结构。
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悬突序列从5′端向3′端方向的转移可刺激bDNA中的B-Z转变。
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含有3′悬突的NF-kB序列被发现对B-Z转变敏感。
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环区含有3T且具有3′悬突序列的bDNA结构适合形成Z-DNA。
引言
左手性Z-DNA在结构上不同于最丰富的B-DNA。然而，瞬时存在的Z-DNA已被证实会影响多种重要活动，包括转录起始、染色体重组、基因表达调控、核小体定位、基因组稳定性以及表观遗传调控 [1], [2], [3], [4], [5]。关于Z-DNA功能的初始线索来源于免疫学研究。这些研究揭示了Z-DNA与B-DNA之间的显著差异。与B-DNA不同，Z-DNA表现出强烈的免疫原性，从而诱导产生多克隆抗体和单克隆抗体 [6], [7]。后续研究确定Z-DNA主要位于活跃转录的基因内部。此外，转录终止会导致Z-DNA迅速转变为B-DNA构象，这一过程由拓扑异构酶促进 [8]。因此，由转录引起的负超螺旋或核小体的解缠绕可稳定具有交替嘌呤-嘧啶序列的左手性构象。近年来，对Z-DNA参与多种人类疾病（包括白血病、自身免疫性疾病和阿尔茨海默病）机制的理解取得了进展，这进一步提升了其研究意义 [9]。最近，高通量测序技术、全基因组映射方法和计算预测算法的进步极大地拓展了我们对Z-DNA生物学的认识。全基因组研究表明，形成Z-DNA的序列（Z-flipons）广泛分布于真核生物基因组中，并在与转录调控、染色质重塑、基因组稳定性和先天免疫信号相关的启动子、增强子及其他调控元件中富集 [10], [11], [12]。与此同时，基于深度学习和机器学习的计算方法极大地改善了Z-DNA形成序列的预测精度，而结构和功能研究已鉴定出ADAR1和ZBP1作为参与免疫调控的重要Z-DNA/Z-RNA传感器 [13]。这些进展突显了理解调控B到Z构象转换的序列和结构决定因素的重要性日益增长。
由于Z-DNA片段在基因组中的动态分布特性 [14], [15], [16]，Z-DNA的形成机制通过使用各种短重复序列进行了研究。主要是在暴露于高浓度单价或二价阳离子或金属配合物时，研究了二核苷酸重复序列和某些异质序列从B-DNA到Z-DNA的转变 [17], [18], [19]。然而，这些研究主要使用短DNA片段作为模型系统。因此，在较长的DNA序列中观察到这种转变的努力十分有限，尤其是在自组装分支DNA（bDNA）纳米结构中 [20], [21]。bDNA纳米材料在基础研究方面具有重要的应用价值，并已在生物传感器、执行器和纳米机械器件中展示了实用性 [22], [23], [24], [25]。由外部因素（如环境化学信号）引发的DNA构象改变对其生化应用至关重要 [26], [27]。特别是，B-Z转变已从纳米技术的角度进行了考察，并被用作多种纳米执行器的驱动力 [28], [29]。
最近，我们的研究小组首次报道了镧系诱导的线性结构和bDNA结构中的B到Z转变 [30]。然而，调控B-Z转变的因素和构象转换的机制尚未被发现。虽然控制Z-DNA形成的外部因素已被广泛研究，并显示其取决于温度、离子环境和盐浓度；但内部因素如核苷酸环长度、悬突序列和核苷酸序列顺序对B-Z转变的关键作用却鲜有研究。此前，一系列在环区或悬突区具有不同序列变化的bDNA纳米结构已被用于研究低浓度镧系阳离子存在下的B-Z转变，结果发现具有5T环区的序列无论悬突序列如何均对B到Z DNA转变具有抗性。然而，该系列的所有结构仅在5′端具有悬突。鉴于寡核苷酸方向在复制和转录过程中起着至关重要的作用，我们假设悬突序列方向的改变（从5′到3′）可能会影响B到Z DNA转变。此外，已知交替嘌呤/嘧啶碱基如CG重复序列可调节B-Z转变。因此，我们进一步假设向bDNA中插入此类小重复序列，可能诱导那些对B-Z转变具有抗性的结构发生B-Z转变。然而，这种将悬突从5′端转移至3′端的方法尚未被用于B-Z转变的研究。此外，3′端悬突在重组和端粒序列维护过程中的作用也显而易见。值得注意的是，DNA降解酶RecBCD与chi序列5′ GCTGGTGG 3′的分子相互作用会改变RecBCD的活性，使RecBCD产生适用于重组后续步骤的3′端单链DNA [31]。其次，在端粒DNA中数百个重复基序5′ TTAGGG 3′之后，发现双链DNA分子的3′端存在短延伸 [32]。此外，新合成的信使RNA的3′端经历转录后多聚腺苷酸化，该过程添加50至250个腺苷酸残基的序列，产生成熟的信使RNA（mRNA）。该多聚A尾在调控细胞内mRNA分子的稳定性方面发挥作用，从而影响从转录本翻译出的蛋白质的数量和质量 [33]。因此，3′端悬突的重要性已随着自然进化而发展，不容忽视。以此为背景，本研究调查了将悬突序列从5′端转移至3′端，包括相同和反向序列方向的情况，而不改变其余序列，以检验bDNA纳米结构中的B到Z转变。
为了进一步检验在合成bDNA系统中发现的结构原理是否可以推广至生物学相关的DNA序列，我们将NF-kβ的共识序列纳入了bDNA结构中。NF-kβ序列作为代表性的调控DNA序列被引入，以在受控的DNA纳米结构中检验序列依赖的构象行为。该设计的目的是作为概念验证，而非作为NF-kβ介导的体内转录调控的直接模型。在这些构建体中，我们观察到当悬突定位在3′端时发生B到Z转变。NF-kβ是一类参与多种细胞过程的转录因子，包括炎症、免疫反应、细胞生长、发育、存活和程序性细胞死亡 [34], [35], [36]。因此，纳入该共识序列提供了一个生物学相关的测试序列，同时将研究保持在合成DNA纳米技术平台的框架内。此外，金属螯合实验也支持了镧系诱导的B到Z转变在自组装bDNA纳米结构中的可逆性。采用多种生物物理技术，包括圆二色性、热融解、荧光光谱、Zeta电位测量和等温滴定量热法，来表征CG重复序列插入和3′端悬突构型对B到Z构象转换的影响。据我们所知，这是首次研究短CG重复序列插入和3′端悬突构型对bDNA纳米材料中B到Z转变的影响。因此，本研究提供了一个受控的合成bDNA平台，用于研究序列架构和结构特征如何影响B到Z构象转换，同时纳入NF-kβ共识序列作为检验生物学相关DNA元件的概念验证。
章节摘要
寡核苷酸的设计与自组装
本研究的寡核苷酸是基于Rattus norvegicus（褐家鼠）β-肌动蛋白基因的引物和反向引物序列以及SOD-1基因的引物序列进行定制设计的 [37], [38]。这些合成寡核苷酸直接从Integrated DNA Technologies（IDT，美国）获得，为脱盐产品。关于设计和所有寡核苷酸序列的详细信息可参见补充表S1-S7。收到后，用Milli-Q
bDNA纳米结构及变体的设计
为了系统研究调控B到Z DNA转变的结构决定因素，以逐步方式设计了一系列自组装bDNA纳米结构。整体设计策略旨在在保持相同核心架构的同时，独立评估环长度、悬突方向和CG重复序列插入对bDNA构象转换的影响。最初，设计了US-1至US-4系列以检验环长度的影响
结论
总之，我们证明短CG重复序列的插入可以立即诱导那些对Z-DNA形成具有抗性的bDNA纳米结构发生B到Z转变。此外，在自组装bDNA的寡核苷酸链的3′端引入悬突可显著增强B到Z构象转换的倾向性。通过使用生物学相关的NF-kβ共识序列进一步验证了该方法的一般性，其中3′悬突
CRediT作者贡献声明
Partha S. Nial：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式化分析，数据整理，概念构思。Umakanta Subudhi：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，监督，项目管理，调查研究，资金获取，形式化分析，数据整理，概念构思。
致谢
本研究由CSIR青年科学家项目（YSP-05）、ESC-401以及Har Gobind Khorana DBT-IYBA项目（GAP-312）资助U.S。本研究还部分由CSIR国家实验室计划下的ULIP IMMT-EM（编号MLP002625）资助。PSN感谢印度政府大学拨款委员会授予的研究奖学金。本文谨献给Alexander Rich教授，以纪念其百年诞辰。
Partha S. Nial|Umakanta Subudhi
