针对Lichtheimia corymbifera的第一代HsbA衍生肽抗体实验评估及具有预测鉴别潜力的候选表位独立计算筛选

《International Journal of Biological Macromolecules》：Experimental assessment of first-generation HsbA-derived peptide antibodies and independent computational prioritization of candidate epitopes with predicted discriminatory potential for Lichtheimia corymbifera

　　

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  七种第一代抗HsbA肽抗体中有五种在受试微生物面板中表现出对 L. corymbifera 的统计学显著体外优先结合。
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  一个独立的计算流程优先筛选出另一组HsbA衍生的肽段。
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  Mu_DP2和Mu_DP3在预测的序列区分度、表面可及性和抗原性综合指标中得分最高。
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  NSWEPSLDGYAGALK是预测的线性表位序列中排名第一的。
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  经计算优先筛选的候选物仍未经实验和临床验证。

引言

真菌感染频繁发生在免疫功能低下的人群中，例如正在进行骨髓移植的患者或遭受严重病毒感染后的患者。这些感染构成了重大的全球健康问题，由于其诊断不足和监测数据有限，其真实负担难以量化。尽管如此，多项研究表明，近几十年来全球发病率稳步上升，主要受糖尿病、恶性肿瘤患病人群扩大以及免疫抑制疗法使用增加所驱动 [1]、[2]。重要的是，侵袭性真菌感染在易感患者中具有高致死率，需要及时进行适当的抗真菌治疗。一个关键的临床挑战是快速区分由毛霉目（毛霉病）[3]、[4]引起的感染与由曲霉（曲霉病）引起的感染，因为两者的临床表现可能相似，但推荐的一线治疗方案不同。因此，快速、易获得的诊断方法——理想情况下能够实现早期的种属水平鉴别——仍然极具价值。

毛霉目感染通常由吸入孢子囊孢子或摄入受污染食物引起，近几十年来其发病率和死亡率均显著增加 [6]、[7]、[8]。临床上最重要的属包括毛霉属、接合霉属和犁头霉属；仅犁头霉属就占欧洲毛霉病病例的相当大比例，并在全球范围内也占有一定比例 [3]、[9]。毛霉病的治疗通常需要多管齐下的方法，包括基础疾病的管理、抗真菌治疗和通常的感染组织手术切除 [6]、[9]。值得注意的是，毛霉病强烈推荐大剂量脂质体两性霉素B [9]，而曲霉病主要使用伏立康唑和/或艾沙康唑治疗 [9A]。因此，快速准确的病因诊断对于指导治疗至关重要 [9]。

目前，诊断依赖于显微镜和病理检查、基于培养的形态学分析以及——在有条件时——先进的分子或蛋白质组学方法 [10]。分子诊断如使用分类特异性引物的PCR、ITS测序和MALDI-TOF对培养菌落的鉴定，对于区分毛霉目物种可以具有很高的敏感性和特异性 [3]、[4]、[11]。然而，其在临床常规实践中的局限性通常与周转时间、成本、对专业设备和技术的依赖以及在某些工作流程中需要培养有关，后者可能延误治疗决策。这些限制促使开发快速、可广泛部署的方法，如基于抗原或抗体的检测方法。近期的工作探索了用于真菌抗原/抗体检测的免疫分析，包括ELISA策略和侧向层流格式，以支持从临床样本中诊断真菌肺病和毛霉病 [12]。

目前基于抗原的毛霉病诊断仍有限：标准真菌生物标志物（半乳甘露聚糖和β-D-葡聚糖）无法检测毛霉目，而针对细胞壁糖蛋白或多糖的实验方法仍处于研究阶段，没有经过验证的临床检测。针对表面暴露、种属信息性抗原的蛋白质方法代表了一种补充策略，通过基于序列的直接区分提供更高的种属水平分辨率。

具有分泌、暴露和种属信息性特征的蛋白质靶点可以支持候选免疫诊断工具的开发。因此，我们聚焦于疏水表面结合蛋白A（HsbA），这是一种据报道存在于多个毛霉目和曲霉物种中的分泌组分 [13]、[14]、[15]。HsbA（PF12296.7）结构域编码一种小型疏水表面结合蛋白，介导真菌菌丝与疏水底物的附着并支持酶解降解过程。虽然HsbA蛋白在功能上是保守的，但其一级序列显示出种属特异性变异，特别是在表面暴露区域，这可能影响免疫原性并提供用于鉴别的分子特征 [13]、[15]。这种广泛分布、细胞外可及性和序列变异的组合使HsbA成为开发鉴别性免疫诊断检测的理想候选物。此外，HsbA已被鉴定为一种在真菌细胞表面可及的分泌细胞外蛋白 [13]、[14]、[15]，表明其在临床标本（包括组织活检、支气管肺泡灌洗液和感染患者血浆）中可能具有可检测性，但有待直接临床验证。

然而，此前没有任何研究系统地评估过HsbA衍生的肽段在广泛的临床相关毛霉目和比较物种面板上的种属鉴别性抗体识别，也没有任何计算框架被应用于基于整合的序列特异性、表面可及性和表位预测标准来优先筛选HsbA肽段区域。本研究通过互补但独立的方法解决这两个空白：

本研究的目的是：(i) 实验评估针对HsbA衍生肽段的抗血清性抗体是否相对于其他受检微生物优先结合 L. corymbifera；以及 (ii) 优先筛选一组具有独立预测序列鉴别潜力的HsbA衍生肽段候选物。我们整合系统发育、结构和抗原性标准来鉴定具有预测序列鉴别潜力的HsbA肽段区域。候选区域通过整合比较序列分析、敏感性-特异性分析、表面可及性预测和表位作图进行优先筛选。所呈现的计算策略和计算机模拟肽段设计具有通用性，适用于未来开发候选种属鉴别检测。

需要注意的是，用于实验抗体生成的肽段（第一代肽段A–F）是在研究早期使用专有的、以抗原性为核心的工作流程选择的，独立于后文描述的计算流程。计算流程随后被开发用于鉴定另一组优先筛选的肽段（Mu_DP2和Mu_DP3），以供未来实验验证。

章节摘要

化学品

除另有说明外，常规缓冲液组分购自Carl Roth GmbH（德国卡尔斯鲁厄）。从其他供应商获得的试剂将在下文逐一标明。

菌株来源

毒力株JMRC:FSU:09682（LCV）和减毒株JMRC:FSU:10164（LCA）来自弗莱堡弗里德里希·席勒大学（FSU）的自有菌株收藏。

犁头霉属菌株在麦芽浸出物琼脂培养基（40 g L^?1麦芽浸出物、4 g L^?1酵母浸出物、15 g L^?1琼脂）上于37°C培养7天，使其充分

结果

第一部分：第一代HsbA衍生的寡肽实验可行性评估。

HsbA蛋白作为具有预测种属鉴别潜力的候选靶点

HsbA蛋白被选为本研究的靶点，基于以下几个关键因素。首先，HsbA已被鉴定为毛霉目和曲霉物种中的一种分泌性真菌蛋白，如多项研究所示 [13]、[15]。值得注意的是，一项研究发现 L. corymbifera 中有四个HsbA旁系同源物 [15]。这种在真菌类群中的广泛存在支持HsbA作为种属信息性检测策略的候选抗原，同时可能允许种属水平的鉴别。

结论

疏水表面结合蛋白HsbA已被报道为一种分泌性或表面可及的真菌蛋白，提示HsbA衍生的抗原可能在组织或呼吸标本中具有可及性；其在临床标本中的直接检测和诊断性能仍有待确立。

实验部分提供了初步证据，表明所选的第一代抗HsbA抗体在受试微生物中可以对 L. corymbifera 表现出优先结合。

CRediT作者贡献声明

Maryam Almasi：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，可视化，验证，软件，方法学，调查研究，形式化分析，数据整理，概念设计。Oezge Osmanoglu：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，验证，软件，方法学，调查研究，形式化分析，数据整理，概念设计。Mohamed I. Abdelwahab Hassan：写作 – 审阅与编辑，验证，方法学，调查研究。Simranpreet Kaur：写作 – 审阅与

伦理批准与参与同意

无需伦理批准。

未引用参考文献

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利益冲突声明

作者声明他们不存在任何财务或个人方面的利益冲突。

致谢

我们感谢Sara Giddins进行的母语风格校正。此外，我们感谢匿名审稿人的努力和宝贵建议。作者衷心感谢德国研究基金会（DFG）项目编号210879364以及CRC/Transregio124 FungiNet（项目A6 - KV，项目B1 - SKG和TD）的支持。TD还感谢DFG项目编号492620490/INF以及关于感染决策步骤的SFB 1583项目。本文发表得到

Maryam Almasi|Oezge Osmanoglu|Mohamed I. Abdelwahab Hassan|Simranpreet Kaur|Shishir K. Gupta|Kerstin Voigt|Thomas Dandekar