《International Journal of Biological Macromolecules》：Alginate-based films incorporating bacteriophage vB_EcoM-P34 for
in situ biocontrol of
Escherichia coli O157 on Kashar cheese
编辑推荐：
•将特异性感染大肠杆菌（Escherichia coli）的噬菌体整合入藻酸盐中，用于制备抗菌薄膜。•噬菌体的使用不影响藻酸盐薄膜的理化性质和机械性能，同时赋予其抗菌功能。•经活性包装材料薄膜处理的奶酪中，大肠杆菌（E. coli）数量显著减少。•所开发的藻酸盐薄膜在食品保藏
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将特异性感染大肠杆菌（Escherichia coli）的噬菌体整合入藻酸盐中，用于制备抗菌薄膜。
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噬菌体的使用不影响藻酸盐薄膜的理化性质和机械性能，同时赋予其抗菌功能。
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经活性包装材料薄膜处理的奶酪中，大肠杆菌（E. coli）数量显著减少。
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所开发的藻酸盐薄膜在食品保藏方面展现出良好的应用前景。
引言
大肠杆菌（Escherichia coli）O157:H7 是肠杆菌科的一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，也是全球最重要的志贺毒素产生性大肠杆菌（STEC）血清型之一。由于其感染剂量低且能够产生志贺毒素，它是导致出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征等严重疾病的主要食源性病原菌之一[1], [2]。大肠杆菌在食品加工环境中的发生和持久存在，对整个食品生产和加工链条构成潜在的污染风险[3], [4]。反刍动物，尤其是牛，是其主要储存宿主，通过粪便排出促进奶及乳制品的污染。在乳制品行业，大肠杆菌O157:H7 仍是一个关键的安全隐患，特别是在未巴氏杀菌的奶酪等生产品或最小程度加工产品中。这些产品在加工、分销和储存等多个阶段均特别容易受到污染[1], [5]。该病原菌能够在冷藏条件下存活并耐受中度酸性环境，这进一步增强了其在乳制品基质中的持久性[6]。尽管巴氏杀菌非常有效，但与卫生不达标和加工后操作不当相关的污染风险依然存在[7], [8]。美国食品药品监督管理局（FDA）[9]和美国疾病控制与预防中心（CDC）[7]近期报告的暴发事件调查，包括一起与受污染的生切达干酪相关的多州暴发事件，凸显了未巴氏杀菌乳制品仍然存在的公共卫生风险。
传统的保藏技术，包括热处理、化学防腐剂和物理消毒方法，被广泛用于控制食源性病原菌。然而，这些方法可能会影响食品质量、改变感官特性，或对其目标微生物的特异性有限[10], [11]。此外，消费者对最小程度加工食品和清洁标签食品的需求日益增长，促使了替代抗菌策略的开发，包括天然抗菌剂和非热技术，这些策略旨在确保微生物安全的同时保持食品质量[12]。
在此背景下，噬菌体作为一种高度特异性的生物防治剂，能够选择性靶向细菌病原菌，同时保留有益微生物群[13], [14], [15]。与传统抗菌剂相比，噬菌体具有多项优势，包括在特定宿主存在时能够自我复制、宿主特异性高以及与环境的兼容性[14], [16], [17]。这些特性使其在食品安全领域，尤其是在抗生素耐药性日益受到关注以及对替代保藏策略需求增长的背景下，尤为吸引人[3]。
然而，噬菌体在食品体系中的直接应用可能受到环境不稳定性、加工条件下持久性降低以及在复杂食品基质中分布不均等因素的限制。为克服这些局限，将噬菌体整合入食品包装材料已获得越来越多的关注，作为一种有效的控制释放策略。嵌入噬菌体的包装材料可以增强稳定性、延长抗菌活性，并实现与食品表面污染病原菌的靶向相互作用，从而提高整体食品安全性[18], [19], [20]。
含有天然抗菌剂的食用薄膜或涂层是 combating 病原微生物的一种有前景的解决方案。如今，许多包装材料使用石油衍生的合成聚合物生产。然而，这些合成聚合物对环境和人体健康都有若干负面影响[21]。因此，消费者对可生物降解天然生物聚合物的偏好日益增加，例如藻酸盐、壳聚糖、果胶、醋酸纤维素、黄原胶、甲基纤维素、淀粉和蛋白质[19], [22], [23], [24], [25]。藻酸盐是一种从棕色海藻和某些细菌中提取的天然多糖，由于成本低、生物相容性好、可生物降解、被一般公认为安全（GRAS）、机械性能优良以及耐盐性和对螯合剂的高耐受性，是食品包装薄膜生产中最为常用的生物聚合物之一[24], [26]。尽管如此，藻酸盐薄膜缺乏固有抗菌活性，需要整合活性剂如噬菌体。虽然噬菌体通常直接应用于食品，但将其整合入食品包装系统为食品工业提供了更有效的解决方案[20], [27], [28]。负载噬菌体的抗菌薄膜具有降低微生物生长速率、延长延滞期以及灭活目标食品和包装本身表面微生物的显著潜力[19]。尽管已有许多关于嵌入噬菌体薄膜的研究，但在噬菌体加工过程中的稳定性、释放行为以及在复杂食品基质中的性能方面仍存在挑战，体外功效并不总能转化为实际食品体系中的效果。
从屠宰场废水中分离并在早期研究中表征的噬菌体vB_EcoM-P34[29]被选为模型裂解性噬菌体。它属于有尾噬菌体目（Caudoviricetes），对大肠杆菌O157:H7 ATCC 35150 具有强烈的裂解活性，并对若干肠沙门氏菌（Salmonella enterica）血清型表现出交叉反应性[30]。基因组分析显示不含stx1和stx2基因。由stx1和stx2编码的志贺毒素（外毒素）是大肠杆菌O157的主要毒力因子，也是已知最强效的毒素之一[31]。志贺毒素基因通常由整合到细菌基因组中作为前噬菌体的溶原性噬菌体携带。当前噬菌体被激活时，噬菌体进入裂解期，在此期间诱导志贺毒素的合成[32]。本研究使用的vB_EcoM-P34噬菌体是裂解性噬菌体，毒力基因的缺失支持其作为食品体系中安全生物防治剂的潜力。尽管如此，仍建议采用全面的基因组测序方法进一步确认其安全性，并确保完全排除其他未表征的毒力因子或抗生素耐药基因。此外，噬菌体vB_EcoM-P34表现出显著的环境稳定性，在广泛的pH范围（2-11）内以及高达70°C的温度下保持30分钟仍能维持其活性。这些稳健的特征使vB_EcoM-P34成为整合入藻酸盐基活性包装薄膜的极佳候选物。
本研究旨在评估一种经过充分表征的噬菌体在藻酸盐薄膜体系中的性能。研究目标包括：(i) 研究噬菌体在薄膜基质中的稳定性与释放动力学；(ii) 表征薄膜的理化性质和机械性能；以及(iii) 评估其体外以及对冷藏条件下的卡夏尔奶酪（Kashar cheese）针对大肠杆菌O157:H7的抗菌效力。本研究的创新之处在于将vB_EcoM-P34整合入海藻酸钠薄膜中，并系统地评估其在薄膜形成过程中的稳定性、从聚合物基质中的释放动力学以及在体外和实际食品条件下的抗菌效力。与以往仅关注负载噬菌体薄膜孤立方面的研究不同，本工作提供了一个综合评估，将噬菌体稳定性、递送行为和在复杂乳制品基质中的原位抗菌性能联系起来。该方法解决了当前文献中与噬菌体活性损失、释放行为以及模型体系与实际食品应用之间差异相关的关键局限。
章节摘要
细菌菌株与培养条件
本研究中使用的宿主菌为大肠杆菌O157:H7 ATCC 35150，购自尼格尔德奥默哈利斯德米尔大学食品工程菌种保藏中心[29]。所有实验中，细菌培养物在胰酪大豆蛋白浸液（BHI）肉汤（LabM, Lancashire, UK）中于37°C培养，并在含20%甘油的BHI肉汤中于-80°C保存。
噬菌体vB_EcoM-P34的制备
大肠杆菌O157:H7 ATCC 35150特异性噬菌体vB_EcoM-P34由尼格尔德奥默哈利斯德米尔大学食品工程菌种保藏中心提供。
噬菌体在含噬菌体藻酸盐薄膜中的活性与释放特性
vB_EcoM-P34噬菌体溶液的平均效价为10.31 log PFU/mL。开发基于噬菌体的包装材料的一个基本局限是在包装配方中维持噬菌体的稳定性。在薄膜系统中保持较高的噬菌体活性被认为是其在食品包装中有效应用的关键参数[40]。成膜液和所得薄膜样品中的平均噬菌体效价分别为9.76 log PFU/mL和9.00 log PFU/cm2。与
结论
本研究体外评估了噬菌体在藻酸盐薄膜中的稳定性、释放动力学和抗菌效力，并进一步在卡夏尔奶酪中评价了其性能。结果表明，海藻酸钠为噬菌体vB_EcoM-P34提供了相容且具有保护作用的基质，使其能够被整合入薄膜体系中而不损害结构完整性或功能性能。薄膜成型后噬菌体活性的保持，以及
CRediT作者贡献声明
Gamze Ko?er Ala?alvar：初稿撰写、可视化、验证、方法论、调查研究、数据整理、概念构思。Murat ?a?r? ?i?ek：资金获取、形式分析。Hamza Ala?alvar：初稿撰写、可视化、验证、资源、调查研究、数据整理。Zeliha Y?ld?r?m：审阅与编辑、资源、方法论。
关于生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明
在本工作准备过程中，作者使用了ChatGPT等AI辅助工具来提高稿件中句子的可读性。使用该工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对出版物内容承担全部责任。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究得到土耳其科学与技术研究委员会（TUBITAK）2209-A项目（资助编号：1919B012322275）的支持。
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