综述：用于微囊藻毒素测定的分子识别系统，重点聚焦于 MC-LR

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Molecular recognition systems for determination of microcystins with a focus on MC–LR

　　

摘要
蓝藻（蓝细菌）在淡水栖息地中的生长是导致水质恶化的原因之一，因为这些藻类会产生对人体和动物健康有害的藻毒素。由于微囊藻毒素（MCs）——最著名且分布最广的藻毒素——造成的许多负面影响，必须严格监测其在水体和食品中的浓度。本综述总结了过去五年间开发的用于测定最危险的 MCs 之一——微囊藻毒素 - 亮氨酸 - 精氨酸（MC-LR）——的实验室和非实验室方法的最新技术。本综述还提供了利用天然（抗体和酶）和人工（适配体和分子印迹聚合物）受体系统的 MC-LR 测定方法的比较分析。

引言
蓝藻——蓝细菌——的大量繁殖是全球淡水栖息地水华的主要成因。结果是，水体产生气味和颜色，且其质量下降。蓝细菌生长的原因正在被积极研究，并有多篇综述论文致力于此 [1]、[2]、[3]。蓝细菌繁殖的主要原因是对水体栖息地的人类影响和气候条件的变化。图 1 提供了促进蓝细菌生长的最常见因素，其中最重要的是农业企业大规模施用大量肥料，导致水体栖息地中氮和磷化合物的供应量增加 [4]、[5]。水利设施的建设导致流速降低和水温升高，这也促进了蓝细菌的活跃繁殖。例如，在俄罗斯，受影响最严重的地区是夏季低水位期间的伏尔加河中游和下游流域 [6]。图 1 的中间照片展示了 8 月份伏尔加格勒水库的一部分——大部分水面被蓝细菌覆盖。当蓝细菌死亡并将包括藻毒素在内的细胞内有机化合物释放到环境中时，它们会造成负面影响 [2]。藻毒素在与人类和动物外部接触以及通过水和食物摄入时都会产生负面影响。与此同时，许多水生物种对藻毒素具有抗性，导致毒素在其组织中积累，进而影响食物链中更高层级的动物 [7]。藻毒素表现出多种负面活性，并可分类 [8] 为肝毒素、神经毒素、皮肤毒素和细胞毒素。

微囊藻毒素（MCs）是最著名和分布最广的藻毒素组之一 [7]、[9]，它们显著影响动物和人类健康及其娱乐活动（图 2）。MCs 作为第 1 型和第 2 型 A 蛋白磷酸酶（PPs）的特异性抑制剂，从而改变微小 RNA 表达水平，导致凋亡、自噬、帕金森病、卢·格里格病和阿尔茨海默病，以及损伤内脏器官 [10]、[11]、[12]、[13]。MCs 对肝脏和胃肠道的影响最大 [14]、[15]。

MCs 造成的负面影响要求监测其在水体和食品中的浓度。全面评估水样质量需要测定细胞内和细胞外 MCs 的浓度 [16]。然而，测定细胞内 MCs 需要对目标细胞进行裂解，随后提取毒素。MCs 测定的一般问题包括分析物浓度低以及与基质效应的强烈干扰 [17]。测定样品的总毒性很复杂，因为存在 100 多种结构相似的 MCs，且并非所有它们都有毒 [18]、[19]。最常见的 MCs 的通用结构包括两个决定 MC 名称的可变氨基酸残基和所有 MCs 共有的五个氨基酸（图 2）。这些氨基酸是 D-丙氨酸、D-赤藓糖-β-甲基天冬氨酸、3-氨基 -9- 甲氧基 -2,6,8- 三甲基 -10- 苯基癸 -4,6- 二烯酸（Adda）、D-谷氨酸和 N- 甲基脱氢丙氨酸（Mdha）[4]、[12]、[20]。

分析每种类型的 MCs 都需要样品处理和应用特定的分析方法、技术和标准，从而显著增加了分析的复杂性并提高了 MCs 测定的成本 [21]。多个国家的立法建议仅监测微囊藻毒素 - 亮氨酸 - 精氨酸（MC-LR）的浓度，这是最广泛且毒性最强的 MCs 之一 [22]、[23]。美国环境保护署将 MC-LR 列入污染物候选清单 3，欧盟水框架指令建议定期监测 MC-LR，而世界卫生组织将饮用水中 MC-LR 的最大允许量定为 1 μg L-1（1 nM）[5]、[24]。

目前，已有多种分析方案用于测定水（自来水、河水、湖水和海水）[11]、[25] 以及海鲜 [26]、[27]、[28]、蓝细菌、土壤 [21]、生物组织（肝脏）[29]、[30] 和人体体液（尿液、血清）[25]、[31]、[32] 中的 MCs，包括 MC-LR。较少见的 MC-LR 检测技术及其优缺点在几篇论文中进行了综述（表 A.1）。Massey 等人 [11] 的小型综述重点关注 MCs 测定的主要方法，包括（i）生物方法（小鼠生物测定、蛋白磷酸酶抑制测定和酶联免疫吸附测定）；（ii）化学和仪器技术，主要是带有各种检测器的色谱方法（高效液相色谱（HPLC）、液相色谱 - 串联质谱法（LC–MS/MS）、气相色谱），以及（iii）高效毛细管电泳。第三部分论述了生物传感器的开发，包括基于适配体的系统，并讨论了它们在常规监测和早期预警策略中的应用潜在方案。Kumar 等人 [33] 检查了一系列工作并总结了 2009 年至 2019 年间开发的用于检测和定量测定常见 MCs 的方法和策略，包括 HPLC、LC–MS/MS 和毛细管电泳。该综述还涵盖了生化方法，如蛋白磷酸酶抑制测定和酶联免疫吸附测定。此外，作者还包括了专门讨论生物传感装置的部分。Liu 等人 [34] 重点关注纳米材料在 MC-LR 生物传感中的应用，并讨论了各种基于纳米材料的生物传感策略（电化学、比色、表面增强拉曼光谱、荧光和双模检测）。然而，该综述仅关注众多 MCs 中的一种——MC-LR——并未从受体元件的角度解决分析问题。另一篇综述 [25] 考察了生产用于分析饮用水和人体样品中 MCs 的免疫传感器和核酸生物传感器的各种方法。它讨论了基于光学、荧光、电化学、光电化学、阻抗、发光、压电和核磁共振的免疫传感器。He 等人 [35] 非常简要地综述了 MCs 分析的分析方面，主要描述了 MCs 降解的策略和机制。

初步纯化和浓缩与随后的液相色谱 - 串联质谱法（HPLC 联用质谱）的结合 [36] 被认为是 MC-LR 检测的“金标准”[9]。然而，该方法需要昂贵的设备和耗材，以及高资质的操作人员；它还需要单独的实验室进行测定，因此该技术难以在小企业和偏远地区实施。如今，正在出现一种趋势，用更简单的分析技术取代复杂的实验室测定，这些技术既包括基于受体的技术，也包括不使用受体并允许在野外检测 MCs（包括 MC-LR）浓度的技术。本文致力于比较综述用于 MCs 测定的分析技术，这些技术既利用天然受体系统——抗体和酶，也利用人工受体——适配体和分子印迹聚合物（MIP）。本文比较了这些技术的效率和分析特性，并讨论了它们常规应用的可能性。

章节摘录
天然分子识别系统
抗体已广泛用作受体元件，用于各种分析物（包括 MC-LR）的高灵敏度和特异性测定方法。抗体作为受体的效率由商业化试剂盒的可用性所证实，这些试剂盒旨在测定 MC-LR 和含有 Adda 片段的 MCs 总浓度（表 A.2）。MCs 是最强效的天然蛋白磷酸酶（PPs）抑制剂之一，针对第 1 型和第 2 型 A（PPs）类型 1 和类型 2 A [37]。这

适配体的生产和预测
适配体是单链脱氧核糖核酸或核糖核酸的短核苷酸序列。适配体在体外通过化学选择对具有对目标化合物高亲和力和选择性的核苷酸序列进行生产 [77]。选择过程也被称为系统性进化配体指数富集（SELEX）。SELEX 进行 8–20 个循环 [77]、[78]，每个循环后，选择和富集的寡核苷酸与靶标选择性结合

展望、挑战与前景
目前，有许多关于水华、MCs 繁殖和蓝细菌中毒的报道。MCs 是常见登记的蓝细菌毒素 [189]、[190]、[191]。中毒已报道于北美、中美洲、欧洲、澳大利亚、新西兰和亚洲。尽管 MCs 广泛存在 [192]，但使用潜在受体类型的分析仅限于欧洲和亚洲的几个地区，包括芬兰、俄罗斯和中国（图 4，表 A.4）。

尽管活跃

结论
本综述总结了近年来 MCs 检测受体元件开发的最新进展，特别是 MC-LR，其普遍性与人为因素有关，如水体的积极富营养化和水温升高。本综述考虑了 MCs 测定的最常见类型的受体元件，包括天然受体元件（抗体和蛋白磷酸酶）和合成受体元件（适配体和分子印迹聚合物）。主要

CRediT 作者贡献声明
Kirill Yu. Presnyakov：写作 – 综述与编辑，写作 – 原稿，可视化，形式分析，数据整理，概念化。Mikhail V. Pozharov：写作 – 综述与编辑，形式分析。Polina M. Ilicheva：写作 – 综述与编辑，形式分析。Viktoria D. Gorlo：写作 – 综述与编辑，形式分析。Ilya E. Menyaylo：写作 – 综述与编辑，形式分析。Natalia A. Burmistrova：写作 – 综述与编辑，项目管理。Pavel S. Pidenko：

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢
这项工作得到了俄罗斯联邦科学与高等教育部（基金 FSRR–2026–0004）的财政支持。

Kirill Yu. Presnyakov|Mikhail V. Pozharov|Polina M. Ilicheva|Viktoria D. Gorlo|Ilya E. Menyaylo|Natalia A. Burmistrova|Pavel S. Pidenko
萨拉托夫国立大学化学研究所，俄罗斯萨拉托夫市阿斯特拉罕街 83 号，410012