《Journal of Proteome Research》：Cross-Platform Evaluation Reveals Sample Preparation-Driven Biological Biases despite Advances in Mass Spectrometry Performance in Serum Proteomics
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质谱（MS）仪器与蛋白提取技术的进步正在重塑蛋白质组学；然而，改进后的分析性能是否会改变不同样本制备策略可获取的生物学信息仍不清楚。研究人员使用先前在 Orbitrap Exploris 480 平台上分析过的相同基准血清样本，纳入新推出的 Seer Prot
质谱（MS）仪器与蛋白提取技术的进步正在重塑蛋白质组学；然而，改进后的分析性能是否会改变不同样本制备策略可获取的生物学信息仍不清楚。研究人员使用先前在 Orbitrap Exploris 480 平台上分析过的相同基准血清样本，纳入新推出的 Seer Proteograph ONE 工作流程，开展跨平台评估，以确定 MS 进步与样本制备如何影响分析性能与生物学解释。在所有制备策略中，timsTOF HT 通过增加蛋白与肽段鉴定数、减少缺失值、改善加标实验线性（尤其对低丰度蛋白）提升了分析性能。尽管有这些改进，样本制备仍是可获取血清蛋白质组的主要决定因素。功能富集分析揭示跨 MS 平台可重复的工作流程特异性偏差：纳米颗粒富集拓展了更广血清蛋白的可及性，并改善细胞因子和趋化因子等相关标志类信号蛋白检测；耗竭策略则呈现受体相关活动为主的独特功能谱。结果表明 MS 进步提升分析性能，但不消除样本制备驱动的生物学可及性差异，并为按标志物与通路目标选择血清蛋白质组学工作流程提供框架。
研究背景方面，基于液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学虽已成为复杂生物体系大规模蛋白鉴定与定量的重要方法，但人血清因蛋白丰度跨越十余个数量级、少量高丰度蛋白掩盖低丰度物种，始终是高难度基质。既有样本制备包括全蛋白质组提取的凝胶内酶解（IGD）与单锅固相增强样品制备（SP3）、降低复杂度的 Top 14 高丰度蛋白免疫耗竭与异丙醇/三氯乙酸（IPA/TCA）沉淀，以及纳米颗粒或工程微珠富集策略。多数比较研究依赖不同来源样本与不同分析流程，难以区分生物学变异与方法学效应；且既往制备比较多限于单 MS 平台。因此，在 MS 仪器持续进化（如 timsTOF HT 将离子淌度与并行累积串行碎裂（PASEF）结合）背景下，仪器进步能否克服或改变样本制备带来的生物学偏差尚不清楚。研究人员因此在《Journal of Proteome Research》发表该项研究，用同一生物材料跨两类根本不同的 MS 平台与多种制备流程，分离“分析性能提升”和“生物学可及性变化”。
主要关键技术方法上，研究人员复用既往 Orbitrap Exploris 480 数据集，并在 Bruker timsTOF HT 上新增测量；样本为同一混合人血清池按相同方案制备的加标血清，加标 7 种蛋白设 4 个浓度梯度并有非加标对照，六种原有流程各含技术重复，新增 Seer Proteograph ONE 仅在 timsTOF HT 评估。鉴定用 Spectronaut 20 比对人类 Swiss-Prot 数据库，Orbitrap 数据做 MS1 水平无标记定量，timsTOF HT 数据用 dia-PASEF 与 MS2 默认无标记定量，Perseus 按每流程重复中至少 60% 检出过滤缺失值，加标蛋白用线性回归评估线性，功能解读采用 g:Profiler 做基因本体（GO）富集，并用炎症、癌症、心血管精选标志面板评估临床相关蛋白回收。
MS Instrumentation Significantly Affects Analytical Performance 部分，研究人员通过比较两平台蛋白组与肽段鉴定数、缺失值、重复性与加标线性发现：timsTOF HT 在所有共有流程中蛋白组与肽段鉴定均高于 Orbitrap Exploris 480，Seer Proteograph XT（Seer XT）在两平台都最深，timsTOF HT 上 Seer Proteograph ONE（Seer ONE）达 2475 蛋白组与 24101 肽段；timsTOF HT 缺失值更低、低丰度加标蛋白仍可测且线性更好，但两平台共有蛋白的每蛋白平均肽段支持度相近。结论是高通量 PASEF 类仪器拓展可检测蛋白质组，却不系统性增加已鉴定蛋白的肽段证据。
Sample Preparation Drives Biological Accessibility of the Serum Proteome 部分，研究人员对每方法独特蛋白做分子功能富集并以全部流程鉴定并集为背景：IGD、SP3、IPA/TCA 独特蛋白少且无显著富集，Seer XT 独特蛋白最多且核酸/核苷酸/RNA 结合功能最强，Top 14 耗竭独特蛋白少但富集受体与信号转导功能；Seer XT 与 Seer ONE 有较大重叠，差异主要是深度而非功能选择性。结论为样本制备策略本身决定可进入分析的蛋白空间，仪器不重排该空间。
Functional Characterization of Disease-Marker Proteins across Sample Preparation Strategies 部分，研究人员用炎症（n=557）、癌症（n=213）、心血管（n=166）标志面板比对各流程总鉴定：Seer 纳米颗粒流程回收最多，其次 Top 14 与 PreOmics ENRICH-iST（PreOmics），IGD/SP3/IPA/TCA 较低；Seer XT 特有标志最丰富且富集细胞因子活性、趋化因子相关、信号受体结合等，Top 14 特有标志富集受体活性与分子转导功能。结论为临床相关低丰度信号蛋白的可及性由制备化学原理决定。
讨论部分总结：研究人员指出跨平台差异中 LC 配置与采集策略不可完全分离，但峰容量相近说明色谱不是主因；重复性主要由样本制备主导，现代 MS 在优化条件下精度相当；timsTOF HT 新增鉴定主要扩展已有功能空间而非引入全新功能签名。研究结论部分译为：在所有评估流程中，timsTOF HT 质谱平台显著提升分析性能，增加蛋白质组深度、减少缺失值并增强定量表现，但这些收益未重排样本制备策略的相对表现；样本制备不只是前分析步骤，而是可获取血清蛋白质组的主要决定因素，纳米颗粒富集拓展更广蛋白并偏好信号相关蛋白，耗竭策略偏好受体相关蛋白，该偏差跨平台可重复；MS 仪器进步与样本制备应被视为互补而非可互换策略，针对低丰度蛋白与极端动态范围，仍需依生物学问题选制备流程。该研究为按标志物与通路目标选择血清蛋白质组学工作流提供了直接证据框架。
