一种用于犬外周血单核细胞来源巨噬细胞的低血清培养体系，可实现对M0、M1和M2表型及肿瘤相关相互作用的表征

《Veterinary Immunology and Immunopathology》：A serum-reduced culture system for canine PBMC-derived macrophages enables characterization of M0, M1, and M2 phenotypes and tumor-associated interactions

　　

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  采用低血清培养体系生成了犬M0、M1和M2巨噬细胞。
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  观察到不同的形态、吞噬活性和转录特征。
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  RNA-seq鉴定了与巨噬细胞亚群相关的特征性基因。
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  M2巨噬细胞与尿路上皮癌细胞的相互作用类似于肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。
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  低血清培养体系为未来犬巨噬细胞生物学研究提供了有用的平台。

引言

巨噬细胞是高度可塑的免疫细胞，能对生长因子、细胞因子和趋化因子等微环境信号作出反应，获得多样的表型和功能状态（Mantovani等，2004；Sica和Mantovani，2012；Stout和Suttles，2004）。活化的巨噬细胞通常被描述为存在于活化状态的连续谱上，经典活化的（M1）和替代活化的（M2）巨噬细胞代表两种广泛认可的极化表型（Pollard，2009）。M1巨噬细胞由粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、γ-干扰素（IFN-γ）和脂多糖等刺激诱导，产生促炎细胞因子和活性氧，促进炎症反应并发挥杀菌和抗肿瘤活性（David和Kroner，2011；Herder等，2015；Liu等，2014；Sica和Mantovani，2012）。相比之下，M2巨噬细胞由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、白细胞介素（IL）-4、IL-13和转化生长因子-β诱导，分泌抗炎细胞因子，并参与炎症消退、寄生虫防御和组织修复（Liu等，2014；Sica和Mantovani，2012）。

涉及巨噬细胞的慢性炎症与肿瘤发生密切相关（Qian和Pollard，2010）。在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）常表现出类似M2型巨噬细胞的特征，促进肿瘤进展、血管生成和免疫抑制（Pollard，2009）。在伴侣犬中，TAMs越来越多地被公认为肿瘤免疫的关键参与者和潜在治疗靶点（Brady和Thamm，2023）。因此，了解驱动巨噬细胞活化的因素及其细胞因子谱和功能输出对于开发靶向巨噬细胞的癌症疗法至关重要。

此外，巨噬细胞亚群的遗传和功能特征在不同物种间可能存在差异，犬特有的巨噬细胞极化标志物和诱导方案仍未完全表征（Chow等，2022；Heinrich等，2017；Spiller等，2016）。尽管近期研究已利用转录组和功能性方法表征了犬巨噬细胞极化（Chow等，2022；Heinrich等，2017），但用于常规鉴定和诱导犬巨噬细胞亚群的标准标志物组合和培养方案仍然有限。外周血单个核细胞（PBMC）来源的巨噬细胞体外培养通常依赖于补充胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute 1640或Dulbecco改良伊格尔培养基以支持细胞生长。然而，血清含有大量未明确成分，批次间变异可能影响实验可重复性。Macrophage Base Medium（PromoCell，德国海德堡）是一种用于人PBMC来源巨噬细胞培养的无血清培养基。与Monocyte Attachment Medium（PromoCell）联用时，可在不补充胎牛血清的条件下将单核细胞分化为M1和M2巨噬细胞（Gjorgjevski等，2019）。通过减少血清补充，该方法可能有助于减少血清来源的变异并提高可重复性。

本研究的目的是在低血清条件下使用Macrophage Base Medium培养犬PBMC来源的巨噬细胞，并表征其表型、转录和功能特性，包括形态学、吞噬活性以及与犬尿路上皮癌细胞的相互作用。

章节摘要

动物

所有动物实验均按照本机构动物实验指南和法规进行（批准编号：A201918）。本研究使用三只健康比格犬。所有犬均为绝育雄性，年龄4–5岁，体重11–13 kg，饲养于大学动物设施。犬A–C用于巨噬细胞培养；犬A和B用于形态学观察和逆转录聚合酶链反应

PBMC和巨噬细胞数量

从20 mL外周血中分离的PBMC平均数量为27 ± 2.5 × 10?（均值 ± 标准误，n = 16）。使用本培养方法从20 mL外周血中获得的M0、M1和M2巨噬细胞平均数量分别为8.8 ± 1.8 × 10?（n = 6）、4.0 ± 1.1 × 10?（n = 6）和5.7 ± 0.5 × 10?（n = 4）。巨噬细胞相对于PBMC的产率，计算为（巨噬细胞数/PBMC数）× 100，M0为32.7%，M1为14.8%，M2为21.1%。虽然M0巨噬细胞倾向于

讨论

在本研究中，我们建立了使用Macrophage Base Medium在低血清条件下培养犬PBMC来源巨噬细胞的培养体系。所得细胞群表现出不同的形态学、转录和功能特征，与表型上不同的巨噬细胞亚群一致。与犬巨噬细胞研究中常用的含血清培养体系（Bueno等，2005）相比，我们的低血清方法可能减少但无法完全

资金支持

本研究由日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI拨款（编号17K08093）和Neo Pharma Japan Co., Ltd.合作研究基金支持。

CRediT作者贡献声明

Ikunori Naito：撰写——审阅与编辑，调查。Shinji Yamada：撰写——审阅与编辑，调查。Tomoki Motegi：撰写——审阅与编辑，形式分析，数据整理。Yoshio Yamamoto：撰写——审阅与编辑，可视化，调查。Yuki Hoshino：撰写——审阅与编辑，撰写——原始稿件，可视化，验证，监督，资源，项目管理，方法学，调查，资金获取，形式分析，数据整理，

生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明

在撰写本文过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来协助开发图形摘要、参考文献格式化和英语语言编辑。作者根据需要对所有AI生成的内容进行了批判性审阅和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报道的工作。

Yuki Hoshino|Riho Anzai|Saori Kobayashi|Naohiro Uchida|Toshina Ishiguro-Oonuma|Ikunori Naito|Shinji Yamada|Tomoki Motegi|Yoshio Yamamoto