开发一种快速可视化ERA-LFD检测方法用于灵敏检测小瓜虫，并具备在养殖业中的应用潜力

《Veterinary Parasitology》：Development of a rapid and visual ERA–LFD assay for sensitive detection of Ichthyophthirius multifiliis with potential for application in aquaculture

　　

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  新型ERA-LFD用于水产养殖中Ichthyophthirius multifiliis的可视化检测。
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  在43 ℃下18分钟内即可检测鱼类和水样中的单个成熟囊虫。
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  等温扩增实现快速检测，无需热循环仪。

引言

Ichthyophthirius multifiliis（小瓜虫）是一种寄生性纤毛原虫，感染淡水鱼类并引起小瓜虫病（白点病）(Francis–Floyd等人, 2023)。它是淡水水产养殖中最严重的寄生病原之一，可导致未经治疗的鱼类死亡率高达100%，造成的全球年经济损失超过10亿美元(Peng等人, 2025, Naveed等人, 2026)。仅欧洲鳟鱼养殖的年损失就约为1.4亿美元(Maezono等人, 2025, Peng等人, 2025)。该纤毛虫宿主特异性广泛，可感染几乎所有淡水硬骨鱼，导致高发病率和死亡率，尤其在集约化养殖系统中更为严重(Poonlaphdecha等人, 2025)。其生活史简单但效率极高，包括四个不同的发育阶段：未包囊的包囊虫、已包囊的包囊虫、成熟囊虫和入胞虫(Liu等人, 2017)。在最佳水温（15–25 ℃）条件下，从包囊虫释放的成熟囊虫可在数小时内迅速感染鱼类，疾病可在短短一至两周内发展为流行(Buchmann等人, 2001, J?rgensen等人, 2017a)。

及时准确的检测对于控制I. multifiliis至关重要，因为该寄生虫可在临床症状出现前迅速传播(Francis–Floyd等人, 2023)。传统诊断通常通过显微镜检查皮肤或鳃部刮片来查找入胞虫（白点）或水中成熟的囊虫(Li等人, 2023, Li等人, 2023)。然而，该方法耗时费力，且需要大量专业知识来将成熟囊虫与形态相似的自由生活纤毛虫区分开来MacAulay等人 (2022)。此外，虽然在系统性抽样下，低水平感染期间可见的白点可能可被检测到，但在疾病晚期，白点变得明显且广泛分布，此时治疗手段往往无效，且高寄生虫负荷可能已经损害了鱼类的健康Francis–Floyd等人 (2023)。因此，最迫切的实际需求是一种快速、高灵敏度的检测技术，能够同时适用于鱼类和水环境，便于整合到常规养殖管理中，用于白点病的监测、诊断和治疗。

分子诊断技术，包括常规PCR和实时定量PCR (qPCR)，已大幅提高了检测的灵敏度和特异性。这些方法通常靶向保守的遗传标记，如小亚基核糖体RNA (SSU rDNA) (Hu等人, 2023) 和Cathepsin L半胱氨酸蛋白酶（ICP2）基因(Guo等人, 2025)，能够实现亚临床感染和环境DNA (eDNA)的检测。然而，它们对精密热循环设备的依赖、冗长的扩增方案以及扩增后分析（如凝胶电泳）限制了其在野外环境和小型养殖设施中的部署(Howell等人, 2019)。

等温扩增技术作为即时检测（point-of-care）诊断的有前景的替代方案应运而生，其消除了对热循环仪的需求。其中，重组酶聚合酶扩增(RPA)因其快速的扩增速率（通常<30 min）和极低设备要求而备受关注(Piepenburg等人, 2006)。当RPA与侧向流试纸条(LFD)检测相结合时，标记有抗原标签的RPA产物可直接通过肉眼观察进行可视化，从而创建适用于野外应用的"RPA-LFD"一体化平台(Lobato和O'Sullivan, 2018)。酶促重组酶扩增(ERA)是中国基于RPA自主研发的商用改良技术。ERA以其简便、快速、高效的特点，在水产病原体检测中展现出良好的应用前景(Chen等人, 2025, Li等人, 2023, Li等人, 2023, Zhang等人, 2023, Zhang等人, 2023, Zhang等人, 2024, Zhou等人, 2023)。

尽管已有上述进展，ERA-LFD技术用于检测的应用仍属空白。因此，本研究旨在建立并验证一种靶向I. multifiliis线粒体细胞色素氧化酶亚基I (COI)基因的ERA-LFD检测方法，为水产养殖中白点病的早期预警和田间监测提供一种快速、灵敏且无需热循环仪的诊断工具。

章节摘要

病原体、样品及DNA提取

本研究使用了Ichthyophthirius multifiliis、Argulus sp.、Chilodonella uncinata、Cryptocaryon irritans、Trichodina sp.、Gyrodactylus kobayashii、Trypanosoma sp. 和 Dactylogyrus sp.。按照Song等人(2015)的方法，在金鱼（Carassius auratus）中通过连续传代维持I. multifiliis。从重度感染鱼体采集原包囊虫，用蒸馏水冲洗后，在21.5–22.5 ℃下培养直至成熟囊虫释放。通过计数测定成熟囊虫浓度

ERA-LFD检测方法的特异性

在测试的九种引物-探针组合中，四种（Ich-F1+Ich-R3+Ich-P、Ich-F2+Ich-R2+Ich-P、Ich-F2+Ich-R3+Ich-P 和 Ich-F3+Ich-R3+Ich-P）与I. multifiliis DNA产生明确的阳性信号，且与七种非靶标寄生虫的混合DNA无交叉反应（图1）。这四种组合被选用于进一步的灵敏度评估。

最优引物-探针组合的选择

在测试系列稀释的I. multifiliis DNA时，Ich-F2 + Ich-R2 + Ich-P组合检测到了102倍稀释度

讨论

水产养殖中有效的疾病管理关键依赖于对病原体的及时检测(MacAulay等人, 2022)。对于I. multifiliis，成熟囊虫在最佳条件（15–25 ℃）下快速传播意味着，从初次感染到临床暴发可能仅需一至两周(Buchmann等人, 2001, J?rgensen, 2017b)，届时治疗手段有限，集约化养殖系统中的死亡率可能超过90%(Kumar等人, 2022)。尽管兽医诊断

结论

本研究建立的针对I. multifiliis的ERA-LFD检测方法在实验室条件下表现出简便、快速、高灵敏度和特异性。然而，由于其性能尚未在复杂田间基质（如集约化养殖中典型的浑浊、高有机负荷池塘水）中进行评估，该检测方法目前应被视为一种有前景的实验室工具，而非成熟的现场检测手段。未来的工作将重点在于验证该检测方法在

CRediT作者贡献声明

袁雪梅：撰写初稿、资源、构思。陈晶：方法、调查。焦景彪：验证、数据管理。卜霞莲：形式分析。胡宏霞：可视化、项目管理。姚佳芸：撰写-审稿与编辑、指导、资金获取。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到了浙江省"领雁"研发计划(2024C02005)和自治区区域协同创新专项（科技援疆计划，项目编号：2026E01046）的支持。

袁雪梅|陈晶|焦景彪|卜霞莲|胡宏霞|姚佳芸