《Water Research》：Mechanistic insight into the mechanical stability of anammox granular sludge: Roles of polarity, structure and function of extracellular proteins
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摘要颗粒化厌氧氨氧化工艺是一种前景广阔且节能高效的脱氮生物技术，但控制厌氧氨氧化颗粒污泥机械稳定性的机制仍然知之甚少。本研究利用多尺度分析方法，对从五个处理不同废水的实验室规模和中试规模反应器中采集的厌氧氨氧化颗粒污泥样品进行了研究，揭示了胞外聚合物中蛋白质在控制颗粒内聚力和
摘要
颗粒化厌氧氨氧化工艺是一种前景广阔且节能高效的脱氮生物技术，但控制厌氧氨氧化颗粒污泥机械稳定性的机制仍然知之甚少。本研究利用多尺度分析方法，对从五个处理不同废水的实验室规模和中试规模反应器中采集的厌氧氨氧化颗粒污泥样品进行了研究，揭示了胞外聚合物中蛋白质在控制颗粒内聚力和粘弹性方面的关键作用。与不稳定的颗粒相比，稳定颗粒表现出约2.5倍的较低界面自由能、细胞间能量势垒的缺失（0 kT）以及约4.3倍的较大吸附层弹性，这与具有独特三维结构的功能蛋白的协同上调有关。XAD树脂分级显示，疏水性/亲水性胞外聚合物比值和与疏水性相关的色氨酸类物质是与厌氧氨氧化颗粒内聚力相关的关键胞外聚合物特征。表面层蛋白和含纤连蛋白III型结构域蛋白等结构基质蛋白的显著上调，与增强的细胞间相互作用和凝胶网络形成密切相关。重要的是，标注为Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的代表性分泌蛋白表现出富含疏水性β-折叠的核心结构，特别是免疫球蛋白样β-三明治折叠和β-螺旋桨折叠，这些结构可能为胞外基质的组装提供结构支架。周围的两亲性α-螺旋可能赋予蛋白质灵活性和可塑性，并可能有助于提高颗粒的韧性。这些发现推进了对厌氧氨氧化颗粒中胞外蛋白介导稳定化机制的理解，并为优化厌氧氨氧化系统性能提供了有价值的启示。
引言
厌氧氨氧化是一种可持续且节能高效的从废水中脱氮的生物技术。与传统硝化-反硝化工艺相比，基于厌氧氨氧化的工艺具有显著优势，包括减少氧气需求（60%）和有机碳需求（100%）、降低污泥产量（80%）以及减少温室气体排放。然而，厌氧氨氧化工艺的稳定运行往往受到厌氧氨氧化菌生长缓慢及其对环境扰动的敏感性所阻碍。值得注意的是，厌氧氨氧化菌可以聚集形成致密颗粒，从而容纳高密度的功能细菌并增强对不利条件的韧性。因此，维持厌氧氨氧化颗粒的高结构稳定性对于厌氧氨氧化生物反应器的高效运行至关重要。
厌氧氨氧化颗粒的机械特性，特别是内部内聚力，在维持其结构稳定性中起着关键作用。增强的细菌细胞间粘附被确定为厌氧氨氧化聚集的关键因素。颗粒内聚力的降低使得聚集体在外部扰动下容易发生机械失效。值得注意的是，微生物聚集体的细胞间内聚力与其能量耗散行为密切相关，粘弹性已成为聚集体稳定性的关键机械决定因素。累积证据表明，微生物可以分泌大量生物聚合物，这些聚合物组装成交联分子网络，从而赋予微生物聚集体类水凝胶的粘弹性和优异的结构完整性。然而，厌氧氨氧化菌粘弹性行为与宏观颗粒完整性之间的机制联系尚不清楚，有待进一步研究。
胞外聚合物对于维持颗粒结构完整性至关重要。先前的研究强调了多糖在颗粒稳定性中的重要作用。例如，Wang等人报道多糖增强了细胞间粘附并加强了厌氧氨氧化颗粒结构。藻酸盐样胞外聚合物也被确定为影响好氧颗粒污泥结构稳定性的关键胞外聚合物组分。尽管颗粒稳定性通常归因于成胶多糖，但新兴证据表明胞外蛋白也发挥着重要的结构作用。例如，富含色氨酸的蛋白被证明为厌氧氨氧化颗粒胞外聚合物基质提供结构框架。蛋白相对松散的结构通过暴露内部疏水基团促进了厌氧氨氧化菌的细胞内聚力。然而，目前关于厌氧氨氧化污泥中胞外蛋白的研究主要集中于物理化学表征，对其分子组成和结构-功能关系的理解有限。尽管已在厌氧氨氧化颗粒中鉴定出几种结构组分，如富含β-折叠的蛋白和表面层糖蛋白，但已鉴定的结构基质蛋白多样性仍然有限。总体而言，目前仍然缺乏对负责厌氧氨氧化颗粒稳定性的胞外蛋白的全面分子水平理解。
本研究旨在揭示胞外蛋白在控制厌氧氨氧化颗粒机械稳定性中的作用。首先利用多尺度分析方法评估颗粒稳定性，包括流变学测量、带耗散监测的石英晶体微天平和相互作用能分析。随后，通过整合XAD树脂分级、基于质谱的蛋白质组学和蛋白结构域分析，识别与颗粒稳定性相关的潜在功能蛋白。最后，采用AlphaFold3预测代表性分泌蛋白的三维结构，从分子水平揭示颗粒稳定性的结构决定因素。本研究推进了对厌氧氨氧化颗粒中胞外蛋白介导稳定化机制的理解，并为开发和优化稳健的厌氧氨氧化处理系统提供了有价值的启示。
章节摘要
厌氧氨氧化颗粒污泥来源
厌氧氨氧化颗粒污泥样品采集自五个不同的中试规模及实验室规模反应器：（i）处理餐厨垃圾消化液的中试规模气升式反应器；（ii）处理制革废水的中试规模连续搅拌反应器；（iii）处理水产养殖废水的实验室规模上流式厌氧污泥床反应器；（iv）处理合成废水的实验室规模上流式厌氧污泥床反应器；以及（v）实验室规模序批式
相互作用能分析揭示的厌氧氨氧化颗粒稳定性差异
这五个厌氧氨氧化颗粒表现出明显不同的稳定性，如其完整性系数所反映的。在五个样品中，FWD-A表现出最高的完整性系数（20.4 ± 1.1%），其次是Synthetic-S（17.6 ± 0.9%），而其余三个颗粒显示出显著较低的值，范围在4.2 ± 0.9%至8.3 ± 0.7%之间。值得注意的是，Synthetic-U的最低完整性系数（4.2 ± 0.9%）表明其对结构解离具有最大的抵抗力。
为了
结论
本研究从胞外蛋白的功能和结构角度阐明了厌氧氨氧化颗粒稳定性的内在机制。结果表明，增强的颗粒稳定性依赖于更强的细胞间粘附力和更具弹性的细菌吸附层。所提出的胞外蛋白介导稳定化机制可总结如下：（i）丰富的与疏水性相关的色氨酸类物质与增强的颗粒内聚力有关，而协调的
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Shufei He：概念化、调查、形式分析、数据整理、撰写——初稿。Bolan Zhou：方法学、调查、撰写——审阅与编辑。Xing Huang：撰写——审阅与编辑。Zhelu Gao：撰写——审阅与编辑。Likui Feng：撰写——审阅与编辑。Qingliang Zhao：概念化、撰写——审阅与编辑。Shijie You：概念化、撰写——审阅与编辑。Liangliang Wei：概念化、方法学、撰写——审阅与编辑，
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Shufei He：撰写——初稿、调查、形式分析、数据整理、概念化。Bolan Zhou：撰写——审阅与编辑、方法学、调查。Xing Huang：撰写——审阅与编辑。Zhelu Gao：撰写——审阅与编辑。Likui Feng：撰写——审阅与编辑。Qingliang Zhao：撰写——审阅与编辑、概念化。Shijie You：撰写——审阅与编辑、概念化。Liangliang Wei：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、资助
Shufei He|Bolan Zhou|Xing Huang|Zhelu Gao|Likui Feng|Qingliang Zhao|Shijie You|Liangliang Wei
国家与地方联合生物能源开发利用工程研究中心，哈尔滨工业大学环境学院，中国哈尔滨 150090
