综述：CRISPR 驱动的用于金属离子监测的生物传感器：从分子识别到环境应用

《Trends in Environmental Analytical Chemistry》：CRISPR-powered biosensors for metal ion monitoring: From molecular recognition to environmental applications

　　

## 摘要

环境中的重金属对人类和环境均具有危害性。过去，重金属污染的检测依赖于传统分析方法，这些方法耗时、昂贵，且需要复杂设备。近年来，基于核酸可编程特性的多种不同类型生物传感器已相继开发出来。本综述的重点是涵盖基于CRISPR的重金属检测生物传感器的架构、工作原理和性能特征。CRISPR-Cas12和Cas13核酸酶分别通过对单链DNA和RNA的顺式切割，实现了可编程生物传感器的构建。本综述进一步探讨了如何将特定的重金属结合事件转化为核酸信号，并将其与基于CRISPR的分子系统集成。此外，还分析了多种不同类型的信号转导方式，以及用于重金属信号增强的纳米材料。目前，现有技术在复杂基质中金属检测方面表现出良好的回收率，其性能可与电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）相媲美。然而，仍存在大量挑战，包括有机物和竞争性离子的基质干扰、组分稳定性和可扩展性，以及监管标准化等问题。未来的工作可能包括开发智能手机集成的便携式设备、多重检测、微流控芯片实验室集成，以及引入人工智能辅助数据分析。本文提出了一条将实验室进展转化为可靠技术的完整路线图，该技术能够为重金属的现场监测提供全面检测，同时强调了使用真实样品基质进行持续优化的必要性。

## 引言

根据2025年初的数据，重金属污染已升级为重大的全球环境和粮食安全危机，影响了全球约14%至17%的农业用地（约2.42亿公顷），并使9亿至14亿人面临高暴露风险。[1] 金属污染是一个广为人知的环境问题，对人类和生态系统具有严重后果。过量暴露于铅、汞、镉和砷等金属会损害重要器官，干扰神经系统、肾脏、心血管系统和免疫系统，包括导致发育障碍、生殖毒性和致癌效应。这是由于人类活动如工业化、采矿、农业和化石燃料燃烧等原因，将金属引入我们的生态系统所致。重金属暴露的健康效应（在个体和社区层面）可从严重到灾难性不等。[2] 例如，汞已被确认对心血管和神经功能产生不良影响[3]，而砷则与皮肤病变、心血管疾病和癌症相关。[4]

目前重金属分析的传统方法基于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子吸收光谱法（AAS）和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）。这些分析工具可提供痕量级别的检测限，但需要大量样品前处理，成本高昂，且需要精密分析仪器和完善的实验室设施。[5] 同样，AAS对多种金属的检测灵敏度有限，且通常需要耗时的石墨炉程序。[5] 此外，ICP-MS和AAS均依赖集中化设施，由于结果获取的局限性，限制了实时监测。[6] 当前检测方法的局限性表明，建立便携式、快速、简便且经济实惠的检测方法具有重要意义。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）生物传感器因其结合了可编程目标识别、高特异性、强信号放大和温和反应条件等优点，成为极具吸引力的传感平台，非常适合快速、灵敏且潜在便携的应用场景。[7-10] 特别是，Cas12a和Cas13等酶可通过目标激活后的顺式切割或反式切割产生放大的输出信号，使其可与荧光、比色、电化学、侧向流和微流控检测读数集成，用于即时检测应用。[11] 然而，检测非核酸目标物更具挑战性，因为Cas蛋白无法直接识别这些分析物。[12] 相反，目标物必须首先通过转导元件转化为核酸信号。与传统的核酸诊断不同，使用CRISPR/Cas进行金属离子传感需要将金属离子转化为DNA相关的激活事件，这通常通过使用识别元件来实现。一旦完成转化，Cas12a等酶可通过反式切割活性放大信号，从而实现灵敏检测。

尽管有关CRISPR/Cas生物传感器用于环境分析物的文献日益增多，[13] 但专门针对金属离子检测的讨论仍然有限。因此，本综述旨在总结并批判性地讨论当前已开发的用于重金属检测的CRISPR/Cas生物传感器。我们着重介绍了用于将金属离子识别转化为CRISPR/Cas反式切割活性的多种信号转化策略，包括脱氧核酶、适配体、结构转换设计和其他刺激响应探针。我们还讨论了这些平台中采用的主要信号转导形式，如荧光、电化学和比色读数。总体而言，本综述全面概述了基于CRISPR/Cas的重金属检测策略，并为该领域的未来研究和技术发展提供了前瞻性的视角。

## 章节摘要

### 传统重金属检测技术的局限性

量化重金属的"金标准"方法是ICP-MS，因其卓越灵敏度和同时测量多种元素的能力而备受推崇。[14] 在分析过程中，样品被注入氩等离子体并在高于6000°C下电离。随后，离子通过四极杆或高分辨率磁扇形分析器按质荷比进行分离。[5,15] 尽管分析性能优越，ICP-MS也存在显著缺点，包括高昂的购置成本和维…

### CRISPR/Cas生物传感器检测金属离子的机遇

CRISPR-Cas系统作为古菌和细菌中的适应性免疫系统运行。该系统通过提供针对入侵噬菌体和其他可移动遗传元件（如质粒）的特异性序列保护，防止这些感染。该系统的记忆能力源于将入侵者来源的短DNA片段（间隔序列）整合到宿主基因组中的CRISPR阵列中…

### 脱氧核酶

基于脱氧核酶的CRISPR/Cas重金属检测生物传感器通过两阶段分子转导机制运作，首先由催化性核酸受体识别目标离子，然后将其转化为可被CRISPR读取的放大信号。在第一阶段，金属离子依赖的脱氧核酶作为主要识别元件。与特异性靶标配位后，脱氧核酶发生催化激活并切割设计的底物链，通常…

### 纳米材料集成以实现性能增强

纳米材料和纳米技术提供了一条战略途径，弥合了实现更好的信号转导与整合多功能元件以增强反应机制之间的差距。它们的贡献基于其物理和化学特性以及表面功能化方法来改进信号转导机制。例如，金纳米颗粒（AuNPs）和量子点（QDs）可以促进识别元件的表面固定…

### 特定重金属（Pb、Hg、Cd、As）的检测

已开发的用于检测重金属的CRISPR-Cas12a生物传感器在优化的实验室测试条件下，其性能达到或接近世界卫生组织指导水平。例如，GR-5脱氧核酶平台结合CRISPR-Cas12a及不同的扩增策略，在检测铅时可获得0.05至0.5 nM（10–100 ng/L）之间的检测限；[58,59] 这些检测限显著低于世界卫生组织10 μg/L的指导值。此外，电化学与荧光混合…

### 特异性和基质干扰问题

环境样品由复杂的有机化合物混合物、悬浮物和高浓度的非目标离子（Ca2?、Mg2?、Fe3?…）组成。这些化合物可能影响重金属与识别元件的结合能力或抑制自由离子的可用性，同时也可能直接干扰核酸的折叠、杂交或酶活性。腐殖质物质尤其以抑制荧光的能力著称，[66] 同时抑制Cas酶的活性…

### 开发全便携式和智能手机集成设备

CRISPR生物传感与无处不在的移动技术的融合，为让人们普及环境监测带来了令人振奋的前景。下一代设备旨在将自动化流程集成到便携式廉价试剂盒中，包括样品制备（过滤、样品富集）、信号放大（或直接检测核酸）、CRISPR检测[88]以及多种检测方法和多种读数模式…

## 结论

利用可编程核酸构建CRISPR-Cas系统，并结合功能性核酸传感器（脱氧核酶和适配体）的生物传感器，代表了一种监测环境中重金属存在的令人振奋的新兴技术。这些生物传感器平台能够以极低的浓度（通常在皮摩尔级别或更低——经过优化后）检测重金属，被视为与传统实验室设备互补的工具。

## CRediT作者贡献声明

Prabir Kumar Kulabhusan：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，可视化，监督，资源，项目管理，研究，资助获取，概念构思。
David Septian Sumanto Marpaung：撰写——审阅与编辑，资源，方法论，正式分析，概念构思。
Guozhen Liu：撰写——审阅与编辑，验证，项目管理，研究，资助获取，数据管理，概念构思。

## 生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的使用声明

在准备本文期间，作者使用Paperpal提高了可读性。在使用该工具/服务后，作者对内容进行了审阅和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。

## 利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

## 致谢

PKK通过玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里行动博士后奖学金获得资助（项目编号：101066736）。GL感谢中国国家自然科学基金（22174121、22211530067、T2250710180）、2022年广东省基础与应用基础研究基金（广东Hybribio）、广东省珠江人才计划（2021CX02Y066）、深圳湾开放实验室基金2021、CUHKSZ-Boyalife联合实验室基金，以及1+1+1 CUHK-CUHK(SZ)-GDSTC项目。

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