《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Lineage relationships in muscle stem cells: linking functional fate to molecular state
肌肉干细胞（MuSCs）代表卫星细胞（SCs）的一个亚群，构成骨骼肌组织的干细胞区室。MuSCs和SCs在稳态条件下处于静止状态，但在损伤时被激活以驱动再生和干细胞池的再增殖。异质性已成为MuSC生物学的核心问题，促使研究人员通过经典和现代实验方法定义MuSC谱系进展。然而，由此产生的谱系进展模型之间的关系仍不清楚。经典谱系示踪和移植研究揭示了功能异质性并提示了层级组织结构。下一代测序和单细胞技术后来解析了分子异质性，并提出了连续状态转变的动态模型。这两种模型通常被独立解读，其相互关系常被忽视。在本综述中，研究人员批判性评估了静止到激活转变期间MuSC区室功能和分子异质性的现有证据，强调谱系进展模型以及再生微环境和返回静止机制的贡献。研究人员特别探讨了功能命运与分子状态之间的联系，提出一个谱系进展模型，在该模型中这些概念并非相互排斥，而是根据水平和特定转变相互交织。认识到功能干性与动态分子状态转变之间的关系，应鼓励未来的实验设计将谱系示踪和移植与单细胞多组学相结合，以获得对MuSC功能的整体视角。这对于更好地理解疾病和衰老中的MuSC缺陷是必要的，并为开发全面靶向功能命运和分子状态联系的治疗策略铺平道路。
1 引言
卫星细胞（SCs）最初通过骨骼肌组织的电子显微镜描述被发现，它们位于肌纤维基底层下方，这一定位赋予了其原始名称。肌生成的分子遗传学基础由相关研究推进，该研究证明生肌转录因子Myf5或MyoD是骨骼肌形成所必需的。Pax7随后被鉴定为节点转录因子，是SC特化和维持所必需的，Pax7缺陷小鼠未能建立和维持SC池。事实上，Pax7在非肌肉细胞中异位表达时足以诱导生肌特化。Pax7直接调控Myf5，而其与MyoD的关系是相互的，这带来了控制生肌祖细胞停滞和分化的平衡。
体细胞干细胞被定义为能够长期自我更新并具有多能性。SCs的长期自我更新首次被证明是在发现单个肌纤维上约10%的卫星细胞移植到肌肉后能够填充肌肉并在多轮损伤中补充卫星细胞池。这后来通过单细胞移植实验进入再生肌肉后进行克隆追踪和连续移植得到证实。总之，这些实验确定了一部分SCs能够植入、增殖、自我更新，并在重复损伤后维持多轮再生，确认了长期自我更新。重要的是，成体肌肉中的一部分SCs能够分化为棕色脂肪细胞以及生肌祖细胞。多能性通过谱系示踪和克隆分析均得到证实。这种多谱系潜力也在体内对冷暴露的反应中被观察到。如第4.1节所讨论，SC谱系示踪研究发现，在典型的动物房温度下，SC命运主要限制于生肌细胞。总之，这些研究奠定了SC生物学的概念基础，并鼓励进一步研究再生过程中SC的异质性。
用于谱系示踪的遗传报告模型，辅以移植，揭示了SC池在再生潜力上存在差异，某些亚群表现出更高的长期自我更新倾向。这些发现确立了SC池的功能异质性，并催生了层级框架。随后下一代测序的进展，特别是在单细胞分辨率水平，使得绘制再生过程中SC亚群的分子图谱成为可能，并揭示了更高水平的分子异质性。这些方法还允许检查再生过程中的动态性和可逆性，引入了分子状态转变的概念。
功能研究和分子研究解决的是不同性质的生物学问题，不应被视为矛盾的；这两种框架之间的精确关系尚未正式确立。在本综述中，研究人员区分功能命运与分子状态：状态连续性不被提议与命运可逆性平行，因为两者是通过不同方法评估的。研究人员进一步区分谱系记录证据，例如来自Myf5Cre;R-YFP的证据，因其通过移植验证与功能命运更直接相关，而非来自活体报告基因和测序研究获得的转录谱。因此，Myf5表达本身不被视为直接的命运证据，伪时间推断被视为转录进展而非谱系定型。
2 经典层级模型
SCs层级组织的最早证据来自对分离肌纤维上静止SCs的表征。大多数SCs共表达Myf5（生肌定型早期转录调控因子）和CD34。作者推测一小部分Myf5-/CD34-亚群代表更原始的干细胞样群体。该研究引入了SCs在分子水平上层级组织的概念。
层级通过Myf5-Cre/ROSA26-YFP谱系示踪正式确立，证明约10%的成体SCs从未表达过Myf5。这些细胞代表Pax7+/Myf5-卫星干细胞群体，区别于占主导的Pax7+/Myf5+定型祖细胞区室。向Pax7?/?肌肉的功能移植实验进一步表明，Myf5-细胞能有效再增殖卫星细胞龛并支持连续多轮再生，而Myf5+细胞显示有限的自我更新能力并发生早熟分化。较早的研究已确立SC池的自足性，表明新鲜分离的SCs能够在没有替代祖细胞来源的情况下再生肌肉并重建SC龛。总之，这些发现通过将干细胞与祖细胞身份与Myf5表达历史的稳定差异联系起来，在功能上将层级模型锚定。然而，需要承认的是，Myf5表达后来被证明是分级而非二元的，Myf5low细胞与Myf5-细胞共享特征，这将在第3.1节深入讨论。这是特定遗传报告模型发展带来的细化，缓和了Myf5二元分类而不否定它。该层级被认为主要（尽管非排他地）依赖于不对称细胞分裂：激活后，Pax7+/Myf5- SCs沿顶-底轴分裂，产生更具干细胞性的基底Pax7+/Myf5-细胞和更定型的顶端Pax7+/Myf5+细胞。此外，互补证据鉴定了一群进行选择性、非随机模板DNA链分离的标记保留SCs，与干细胞样行为一致。
总之，这些研究建立了一个模型，其中SC异质性被解释为细胞层级的产品，由Pax7+/Myf5-干细胞、Pax7+/Myf5+/MyoD+定型祖细胞和Pax7-/myogenin+分化成肌细胞组成。在该框架内，谱系进展被认为主要是单向的，由生肌调节因子Myf5、MyoD、Myogenin和MRF4的顺序活性控制，恢复到干细胞样状态不被视为模型的核心特征。因此，SC区室内的功能异质性主要被视为具有稳定而非动态可逆身份的固定细胞群体的内在属性。
3 MuSCs在静止到激活转变期间的异质性
3.1 功能异质性
如前所述，静止SCs中主要的干性区分由Kuang等人基于Myf5表达做出，Myf5- MuSCs显示出更高的干性和植入潜力，以及多能性。这一核心工作得到了近期数据的支持，这些数据鉴定了两个Myf5表达细胞亚群，Myf5low和Myf5high；Myf5low细胞与Myf5-亚群共享几个特征，包括更深的静止和更大的自我更新能力。另一项研究通过测量MuSC分裂率揭示了进一步的异质性层次，在成体骨骼肌中区分慢循环和快循环亚群。MuSCs通过TetO-H2B-GFP报告基因在体内进行遗传标记，通过H2B-GFP荧光的保留追踪增殖历史，鉴定出两个不同的亚群：标记保留和非标记保留细胞。标记保留细胞（LRCs）进行了三到五轮分裂，而非LRCs进行了六轮或更多。慢循环LRC表型与更深的静止、更高的干性以及对Pax7表达细胞和肌核的更大贡献相关。有趣的是，这种异质性在胚胎发生期间不存在，此时微环境整体处于增殖状态。总之，这些观察表明激活时的功能差异可能由静止MuSC池中已存在的异质性驱动和预测。
3.2 代谢异质性
尽管对MuSC代谢异质性的理解远未完成，新兴研究开始探讨特定代谢途径依赖性如何塑造MuSC静止到激活转变。早期工作提出MuSC向激活的转变伴随着从脂肪酸氧化到糖酵解的代谢途径转换，表明该过程中的代谢重塑而非仅仅反映能量需求增加。代谢途径转变在MuSC再生过程中被进一步表征，显示静止MuSCs依赖脂肪酸氧化支持的线粒体氧化磷酸化，激活MuSCs依赖糖酵解，分化成肌细胞依赖氧化磷酸化，表明MuSC通过肌生成的进展依赖于不同的代谢开关。此外，线粒体重塑被提出作为该转变的主动调节因子。OPA1介导的线粒体融合维持MuSC深度静止，而激活伴随线粒体碎片化。与此一致，线粒体脂肪酸氧化对MuSC再生至关重要，脂肪酸氧化缺失损害MuSC增殖，强调代谢通量影响再生能力。
3.3 表观遗传水平的异质性
MuSCs另一个新兴的异质性层次在于染色质景观。早期见解来自静止和激活状态下MuSC表观遗传状态的全局分析。静止MuSC表观基因组大部分是许可性的，以激活标记H3K4me3为主，仅含少量抑制性H3K27me3成分。激活后，H3K4me3保留而H3K27me3在转录起始位点增加，产生更具抑制性的景观。Pax7本身——核心生肌转录因子，在静止期表达最高——通过与Wdr5–Ash2L–MLL2组蛋白甲基转移酶复合物结合激活生肌程序，指导H3K4三甲基化。Myf5是Pax7的直接靶标，进一步将染色质动力学与MuSC异质性联系起来。Pax7介导的Myf5转录诱导后来被证明依赖于Carm1（一种精氨酸甲基转移酶）对Pax7的甲基化。Carm1介导的甲基化不改变Pax7 DNA结合动力学，但增加Pax7靶基因启动子处的H3K4me3。与异质性相关，Carm1与Pax7的结合在未定型的Myf5-区室中被抑制，并且是驱动Myf5表达和肌原前体定型所必需的。Carm1的活性反过来受其通过p38γ/MAPK12的磷酸化状态以及不对称分裂期间基底侧浓度（由肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物结合介导）的调控，共同产生具有差异Myf5转录的细胞。染色质动力学因此施加了额外的调控异质性层次，直接作用于Pax7及其靶标（最重要的是Myf5），以定时静止到激活的转变。
3.4 转录水平的异质性
多项研究在转录水平检查了MuSC异质性，这是染色质水平工作的自然延伸。初始单细胞RNA测序使用细胞表达线性扩增测序（CEL-seq）鉴定了静止MuSCs中两个主要的转录不同亚群。尽管两个簇共享大多数基因，一个簇中即时早期应激反应和热休克蛋白转录本表达增加，提示分离诱导的基因表达特征。这些应激反应和热休克蛋白（HSP）基因特征可进一步按胶原酶孵育时间划分，HSPs比即时早期基因诱导更晚。另一项研究在多个时间点（?4天、?1天、?6小时）用4tU在体内标记新生RNA，结合离体标记6小时和新鲜分离MuSCs的全局分析。体内标记的转录组包含各种生肌分化转录本，指向以低整体转录活性为标志的“怠速”或“预激活”状态，可能使转录机制保持激活准备状态。6小时标记细胞富集转录调节因子，而1天和4天标记细胞富集代谢和蛋白质合成。数据还表明MuSC分离期间转录迅速增加——特别是调控早期应激反应、细胞周期和生肌定型的基因——与先前报告一致。主成分分析一致分离样本，提示跨越静止到激活转变的一系列过渡状态值得进一步研究。
基于这些分离诱导应激反应特征，一项研究采用原位固定方法比较原位固定的静止MuSCs与分离后3小时和5小时固定的细胞。这产生了准确的MuSC静止特征并鉴定了早期激活调节因子。主成分分析揭示按时间点的清晰分组，支持静止到激活转变期间转录异质性的观点。3小时和5小时样本与原位固定样本在翻译、细胞周期调控和代谢相关基因特征上不同。
3.5 转录后水平的异质性
超越转录，涉及该转变的mRNA转录后水平调控通过microRNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）介导的翻译控制增加了另一层异质性。miRNAs抑制mRNA翻译，而lncRNAs可以通过充当miRNA海绵等机制调控miRNA活性。早期工作表明miRNAs调控MuSC增殖（miR-133）和分化（miR-1），Pax7被miR-206靶向促进生肌分化。这些发现引发了对miRNAs在MuSC静止维持中作用的研究。miRNAs被证明对主动维持MuSC静止至关重要，miR-489通过癌基因Dek起作用并随MuSC激活逐渐下降。miR-195和miR-497随后被证明通过调控细胞周期进程维持静止。
关于ncRNAs在MuSC异质性中的意义，一项针对Myf5转录后调控的研究证明Myf5转录本被隔离在mRNP颗粒中，受miR-31抑制。激活刺激被证明促进这些mRNP颗粒的解离和miR-31抑制的解除，提示静止期肌生成的“预激活”状态。由于Kuang等人证明10%的SCs从未表达过Myf5，这意味着静止Myf5+池内存在额外的转录后异质性层次。翻译景观被进一步检查，揭示静止MuSCs转录和翻译谱之间的不一致：几个激活相关转录本，包括MyoD1和翻译及核糖体机制的组分，被证明受到翻译抑制。
3.6 激活和细胞命运决定期间的异质性
损伤或疾病时，MuSCs激活并进入肌生成，这需要在自我更新和分化之间做出关键命运决定。该决定由MuSC分裂类型及其定型状态控制，主要由Myf5定义。可以区分三种主要分裂模式：对称Myf5-、不对称Myf5-和对称Myf5+，分别导致通过扩增的自我更新、通过分歧子代命运的自我更新与定型结合、以及定型祖细胞扩增。不对称分裂由有丝分裂纺锤体方向和细胞皮层极性驱动。有丝分裂纺锤体方向需要分区缺陷蛋白3（Pard3），它触发蛋白质募集级联事件，最终定位核有丝分裂装置（NuMA）；NuMA结合中心体和星体微管以设定有丝分裂纺锤体的顶-底方向。极性建立被证明对不对称分裂至关重要。在不对称分裂MuSC的顶端侧，多蛋白PAR复合物组装以强制顶底极性，而基底侧显示Mark2的互补定位，其与肌营养不良蛋白相互作用。这驱动这些蛋白质和复合物的差异分离，产生异质性子细胞。此外，其他蛋白质和RNA也差异分离，包括NUMB及其配体，产生差异NOTCH信号活性——一条对干性维持至关重要的途径。
3.7 返回静止的异质性
MuSC自我更新伴随返回静止，细胞重新进入其稳态状态并等待未来再生需求。由于MuSC激活由受体酪氨酸激酶（RTK）配体FGF和HGF及其下游信号级联驱动，RTK抑制剂Sprouty1（Spry1）——已知在静止MuSCs中升高——在静止维持中被研究。Spry1转录水平与损伤后MuSC激活呈负相关，然后从12 dpi开始上升至20 dpi达到稳态水平，与MuSCs大量返回静止一致。Spry1被证明对MuSCs返回静止至关重要：其条件性缺失通过凋亡耗尽自我更新MuSC池而不影响分化。一项研究通过使用EdU标记保留谱系示踪，在再生时间点脉冲EdU，更仔细地检查了“返回静止”动力学。结果显示大多数（约75%）MuSCs在5–10 dpi返回静止，少数（约24%）在2–4 dpi返回，而在0–2 dpi，所有分裂MuSCs贡献于肌纤维——揭示了静止重新获得时间的异质性。有趣的是，4和7 dpi的互补scRNA-seq数据揭示了返回的Pax7high/MyoDlow细胞簇，富集不对称分裂、自我更新和极性途径。此外，将MuSCs移植到0与5 dpi龛中，后者产生更多自我更新MuSCs，提示外在环境对自我更新/返回静止平衡的贡献。
4 解析MuSC命运和状态：谱系示踪和单细胞测序
4.1 谱系示踪
谱系示踪被认为是评估体内细胞命运决定的金标准，跨时间点追踪标记细胞。MuSC领域包含几种变体。内源细胞可以用掺入的胸苷类似物如EdU或BrdU标记，或转基因小鼠模型与补充化合物如多西环素或他莫昔芬结合以荧光标记细胞。另一种常见方法是移植，即从定义来源（如荧光报告小鼠或人组织）分离目标亚群，移植到高度受控环境（通常为免疫受损、辐照小鼠）中。细胞被允许植入，然后在选定时间点分析。单细胞移植结合连续植入研究提供了自我更新潜力克隆分析的关键方法。谱系示踪在证明MuSC池功能异质性方面发挥了重要作用。
大多数谱系示踪文献提示MuSCs在再生期间有两条途径。第一，MuSCs可以分化并融合到肌纤维，通过量化肌纤维中标记的存在来评估；第二，它们可以自我更新，通过标记与Pax7染色的共定位来评估。很少有谱系示踪研究发现再生后标记的MuSCs位于肌纤维或MuSC龛以外的区室，表明MuSCs主要限于分化或自我更新轨迹，除非在冷暴露等特殊条件下发生向棕色脂肪的转分化。这种分化与自我更新之间的命运平衡对正常骨骼肌再生至关重要，且在激活后相对较早发生。
4.2 单细胞测序
最早的基于时间点的MuSC scRNA-seq研究使用FACS从稳态肌肉、notexin损伤后60小时肌肉和培养的原代成肌细胞中分离MuSCs。该方法揭示了静止期内的转录异质性，根据应激反应相关转录本区分接近静止（cQ）和早期激活（eA）群体，在损伤后60小时解析了三个亚群。将这些群体与原代成肌细胞沿伪时间轴排列，揭示了首个此类基于细胞转录组的轨迹，使MuSC从静止通过激活到分化的进展可视化。后续研究采样多个早期到晚期时间点以捕获瞬时状态。一项研究在notexin损伤后0、2、5和7天对全后肢肌肉细胞悬液进行scRNA-seq；聚焦D0、D5和D7的生肌群体解析了五个不同的MuSC和成熟骨骼肌簇，轨迹分析分离了静止、循环和定型状态。平行研究在再生过程中（cardiotoxin损伤后0、0.5、2、3.5、5、10和21天）分析了全后肢群体，注释了六个生肌簇——静止、免疫成肌细胞、激活、分裂、定型和分化——其比例随时间点变化，轨迹分析将其重现为状态转变。
除scRNAseq方法外，其他单细胞分辨率平台也被应用。一项研究使用单核ATAC-seq分析BaCl2损伤后12、24、48、72和168小时以及未损伤和6和12 hpi对侧未损伤腿的排序全肌肉细胞群体的染色质可及性。该数据集同样揭示了早期到晚期再生时间点上不同瞬时群体和细胞表观基因组状态的动态变化。有趣的是，伪时间分析区分了分化和自我更新轨迹，并推断出一个自我更新簇。再生动力学也被计算建模，微分方程模型准确捕获生肌和非生肌细胞的动力学。
上述大多数研究共享一个主要局限：它们依赖全肌肉分析，以牺牲MuSC区室内分辨率为代价捕获非生肌细胞。一项大规模scRNA-seq整合研究在肌生成轴上实现了MuSC中间状态间分子异质性更解析和更自信的建模，鼓励未来针对MuSC区室的实验设计。
5 层级和连续体模型
MuSC谱系进展传统上由经典层级模型解释，并得到不对称分裂现象的支持，其中MuSC产生转录不同的定型子细胞。然而，来自实现单细胞分子谱分析的技术进步的近期证据揭示了再生过程中的动态状态转变，挑战简单层级模型并提出连续细胞状态模型。因为每个框架的证据来自解决不同生物学问题的不同实验策略，本节依次评估它们并权衡各自优势和局限。
功能上，层级模型很好地解释了MuSCs的持久干性、不对称分裂在命运转变中的作用、将MuSCs分为干细胞与祖细胞的内在差异，以及连续再生维持长期干性。然而，它将谱系进展描绘为可预测、单向和不可逆的（干细胞到祖细胞到分化细胞），而单细胞分子谱分析揭示了更复杂、动态和可逆的景观。
近期基于NGS的单细胞和批量水平分子谱分析研究，结合新的细胞聚类和轨迹推断算法，提示再生过程中MuSC状态的连续谱。连续体模型假设部分共享的转录特征、动态激活轨迹以及无严格边界的可逆转变或命运决定。它能够将转录异质性置于细胞状态背景中，推断渐进激活倾向和预激活，并提出具有潜在返回静止的MuSC可塑性。然而，连续体模型无法正式建立细胞命运关联或证明长期干性能力，这些需要功能性实验设计。
同样重要的是注意轨迹分析的局限性。伪时间排序仅基于转录相似性，在低RNA含量的静止MuSCs中置信度较低。根和方向通常从发育关系的先验知识中选择而非从头开始，细胞组织依赖于所用特定算法。此外，聚类依赖于用户选择的分辨率参数，不反映真实分辨率。这些局限性意味着从轨迹推断获得的粒度和方向性应被视为暂定的参数依赖推断而非验证轨迹。
除谱系示踪和单细胞测序策略外，定量克隆命运图谱提供了解决层级和连续体模型的另一策略。在克隆命运图谱中，单个细胞被标记，其克隆后代随时间追踪，允许统计推断分裂结果。在小鼠中，SC克隆行为被证明依赖于情境。在正常衰老期间，SC克隆多样性得以保留，与固定层级的概念一致；然而，重复损伤时观察到渐进随机克隆漂移，更倾向于连续体。在斑马鱼中，具有克隆分辨率的再生活体成像显示SCs依赖不对称分裂自我更新同时产生祖细胞，提出层级组织。这两项克隆研究使用了不同方法、物种和损伤设置，对SC分裂模式得出不同结论。
层级和连续体解释之间的差异源于两种框架基于不同实验策略。层级被谱系示踪强调，而连续体被单细胞研究强调。谱系示踪追踪命运但不追踪再生期间的分子状态，而单细胞测序则相反。因为命运到状态的链接尚未使用单一实验策略建立，一个核心开放问题仍然存在：MuSCs是由功能命运、分子状态还是两者组合组织的？
6 讨论
6.1 MuSC命运-状态关系的整合模型
在本综述中，考虑MuSC静止到激活转变的集体证据，研究人员得出结论：层级或连续体谱系进展模型都不能单独解释复杂的肌生成过程。层级模型解释了功能不同MuSC亚群的存在，而连续体模型捕捉了高度动态的分子状态。这些模型不应被解释为冲突证据，因为解析两者的实验方法性质不同。两者应被视为互补而非冲突，未来结合它们的研究将提供文献中目前缺失的命运到状态链接。
基于当前文献证据状态，研究人员提出整合模型最能捕捉MuSC谱系进展。功能不同的MuSC亚群，即Myf5-、Myf5low和标记保留细胞，相对于其对应物在长期再生能力上显示差异。同时，跨早期到晚期再生时间点的NGS研究，特别是单细胞转录组学和表观基因组学方法，揭示了不限于功能不同亚群的分子状态转变。然而，几乎总是被忽视的是这两个观察之间的关系。本综述的核心主张是预定功能潜力和分子状态不应被同义解释。相反，研究人员倾向于整合框架，其中功能干性嵌入分子状态连续体中。整合模型代表MuSC亚群内在特征、动态分子状态和再生环境背景的集合。
龛对整合模型贡献至少三个外在层次：毛细血管/内皮来源的存活信号、纤维脂肪祖细胞（FAPs）（其在再生期间本身是动态的）以及瞬时巨噬细胞来源的增殖信号。龛相关异质性，如MuSC区室，也是动态状态依赖而非固定的，这为深入研究再生中涉及的不同细胞群体及其各自意义提出了类似建议。
整合框架提出了几个实际上是可检验的开放问题。例如，功能定义的亚群如Myf5-/low或LRCs是否与分子连续体上的汇聚或不同位置相关。此外，沿连续体的双向移动是否可能在长期干性不丧失的情况下发生，或者存在不可返回点。解决这些问题需要能够捕获单个细胞命运和状态动态的实验策略。例子包括可遗传条形码结合单细胞测序、双Pax7/Myf5报告基因配对scMultiome分析、或状态分选MuSC群体的移植。
MuSC谱系进展中一个未解决的方面是“返回静止”的概念。虽然一些组对全局返回静止进行了初步研究，但应投入更多努力来解析精确时间和机制。随着新技术的出现，实验设计应旨在整合谱系示踪遗传报告模型与移植和单细胞多组学。这将允许追踪功能不同MuSC亚群在再生过程中提出的动态分子状态之间的转变。重要的是，它将能够绘制命运决定的可逆性潜力，特别关注自我更新和返回静止现象。
上述提出的命运-状态关系的具体例证由“G-Alert”状态研究提供。G-Alert状态MuSCs首先在检查初始损伤部位对侧腿的工作中发现，其中细胞已从深度静止（G0）转变为预激活状态。G-Alert功能特征包括线粒体生物发生升高、细胞尺寸增大和损伤时早期细胞周期进入。机制上，这被证明是由于HGF/c-Met信号下游的mTORC1激活。此外，G-Alert MuSCs的移植显示与G0 MuSCs相比再生潜力增加。后续工作发现G-Alert由肝细胞生长因子激活因子（HGFA）在损伤时系统性诱导，将该概念扩展到邻近龛之外。对mTORC1上游调控的进一步研究揭示初级纤毛处的Gli3加工抑制mTORC1以维持MuSCs于G0状态。Gli3缺陷SCs被证明即使无损伤也进入G-Alert并具有增强的自我更新和再生能力。因此，G-Alert代表特定分子状态已与功能命运结果联系的具体实例。
6.2 疾病和衰老中的生物学意义
6.2.1 DMD
骨骼肌最相关的疾病背景是DMD，由肌营养不良蛋白（dystrophin）的遗传缺失引起——该蛋白是肌纤维结构完整性和信号转导所需的——驱动持续退化和再生循环。肌营养不良蛋白被证明也存在于MuSCs中，支持DMD的干细胞内在成分。MuSCs中肌营养不良蛋白缺失被证明通过空间重组不同参与者损害细胞极性建立，最终导致异常有丝分裂纺锤体方向，导致不对称分裂减少。不对称与对称分裂率之间的不平衡导致MuSC增生伴生肌程序定型减少。同时，在mdx模型的胚胎背景中观察到类似现象，继发性肌生成期间胎儿MuSCs比例增加而祖细胞减少。这种不对称到对称分裂不平衡被证明在mdx模型中扩增Myf5- MuSC池而牺牲Myf5+祖细胞。这具体是基于层级框架的读数，代表本节描述的DMD异常之一。尽管MuSCs仍能参与再生，其降低的生肌潜力限制了它们融合和修复肌纤维的定型。
近期研究的另一组证据提示DMD背景下状态动力学的潜在改变。mdx小鼠模型中的MuSCs具有预激活状态尽管缺乏定型。使用scRNA-seq，他们指出了野生型未损伤肌肉中不存在的预激活细胞群体及其各自的激活相关转录程序。除预激活状态外，DMD-MuSCs中的异常极性、纺锤体和有丝分裂问题被证明导致大量经历有丝分裂停滞的细胞，预测将转变为衰老。与此一致，通过scRNA-seq表征，在两个模拟DMD的独立模型（即mdx和D2-mdx）中提出了衰老状态的出现，显示衰老MuSCs比例增加。一小部分但相当比例的DMD-MuSCs被证明正在转变为衰老状态，表现出细胞周期停滞特征和更高的SA-βGal+/Pax7+事件。此外，在其他肌营养不良症背景下，如强直性肌营养不良1型（DM1），通过scRNA-seq显示了成肌细胞衰老亚群的存在，具有特征性衰老相关分泌表型（SASP）产生，促进慢性炎症和纤维化环境。SA-βGal+/Pax7+和细胞周期停滞证据为这里的衰老提供了最强功能支持，而scRNA-seq的转录特征（包括DM1 SASP谱）被视为补充证据而非衰老证明。此外，MuSCs通过Wnt-Tgfβ2信号轴触发内在纤维化程序，这是DMD疾病进展的特征。总之，这些研究表明DMD不仅涉及功能干性缺陷，还涉及状态异质性的重构，预激活和衰老状态扩增而牺牲健康再生状态。因此，DMD表型的扰动不能仅用内在功能干细胞群体或分子状态失调的破坏来解释。相反，两者的整合加上慢性缺陷再生环境，最终导致DMD-MuSCs再生潜力的改变。
6.2.2 衰老
关于衰老中MuSC动力学的文献现状存在激烈争议。一些研究报告MuSC数量下降和克隆扩增减少，导致再生受损，而其他研究发现MuSC数量无变化。这些观察差异归因于每个研究所用模型的性质。一项早期研究表明衰老不仅仅是MuSC丰度的下降，并提示衰老影响MuSC状态调控，特别是静止维持，其中衰老龛的Fgf2信号推动不合时宜的MuSC静止到激活转变，导致逐渐耗竭。这些观察将MuSC衰老的观点从单纯的干细胞耗竭现象转变为功能干性和静止维持机制等的逐渐破坏。
越来越多的努力投入到解析调控衰老MuSCs静止到激活转变的特定调控机制。研究衰老环境对MuSC行为影响的研究表明，几个信号途径影响MuSC内在特征。JAK-STAT信号被证明影响MuSC定型并导致MuSC池耗竭，P38-MAPK信号被证明改变不对称分裂和自我更新动力学，NOTCH信号下降被证明破坏静止维持并导致早熟分化。除信号途径修饰外，几篇出版物显示了表观遗传改变、代谢变化和转录异质性丧失。由polycomb-repressive-1（PRC1）复合物介导的INK4a位点表观遗传抑制在衰老中被证明减少，导致静止到激活转变中p16早熟表达，促进前衰老状态。MuSC静止到激活转变的代谢动力学也随年龄改变。观察到的具体变化被证明因实验模型、组织和衰老阶段而异。年轻MuSCs激活时从脂肪酸氧化转向糖酵解，而衰老MuSCs在某些模型中被证明日益依赖糖酵解，并具有受损的线粒体动力学和电子传递链功能，共同导致氧化磷酸化能力降低。此外，MuSCs被证明在衰老中表现出转录异质性丧失，激活相关程序改变和群体多样性降低。另一项近期研究显示衰老MuSCs中“真正状态”MuSCs减少，被描述为具有更高干性特性的MuSCs。总之，这些发现表明衰老通过影响功能命运转变和分子状态异质性逐渐重塑再生景观。
衰老景观的动力学支持整合框架。一项中心异时共生研究表明，年轻全身环境使衰老MuSCs rejuvenated，而衰老环境阻碍年轻MuSCs。虽然该观察不单独建立整合模型，它提供了龛和全身因素也影响MuSC功能的可靠证据。这支持功能命运或分子状态单独都不足以解释衰老中肌生成维度的观点。综合考虑功能、分子和龛水平贡献描绘了MuSC衰老的更完整图景。衰老因此补充DMD说明层级或连续体框架单独都不足以理解MuSC动力学。
