《Frontiers in Microbiology》：Engineering the acid-tolerant yeast Issatchenkia orientalis for efficient lactic acid production via optimized glucose and xylose utilization
编辑推荐：
耐酸酵母Issatchenkia orientalis是可持续生产有机酸的具潜力平台。然而，木质纤维素生物质来源糖的高效转化受碳分解代谢物阻遏（CCR）影响而效率低下。研究人员建立了通过协调己糖激酶（HXK）调控与转运水平工程实现葡萄糖–木糖共利用的靶向遗传框
耐酸酵母Issatchenkia orientalis是可持续生产有机酸的具潜力平台。然而，木质纤维素生物质来源糖的高效转化受碳分解代谢物阻遏（CCR）影响而效率低下。研究人员建立了通过协调己糖激酶（HXK）调控与转运水平工程实现葡萄糖–木糖共利用的靶向遗传框架。序批补料发酵显示，木糖启动补料策略的乳酸得率比同步发酵高2.04倍。为绕过碳分解代谢物阻遏（CCR），研究人员表征内源己糖激酶（HXK）并进行单缺失（hxk1Δ、hxk2Δ或hxk3Δ）以削弱葡萄糖优势；虽提高乳酸得率，但造成严重动力学瓶颈。为此整合异源糖转运蛋白，植物来源AtSWEET7与酵母来源LST1；在完整背景下，来自Lipomyces starkeyi的主要易化超家族（MFS）型LST1优于AtSWEET7。双拷贝整合LST1得到工程菌SD108XL-LST2，在约45 g/L葡萄糖和44 g/L木糖混合底物中56 h达53.4 g/L乳酸，终得率0.63 g/g、体积产率0.96 g/L·h，较亲本SD108XL分别提高57.5%与47.7%。该转运驱动策略在保留必需糖酵解信号的同时超越天然代谢层级，为木质纤维素生物炼制提供框架。
《Frontiers in Microbiology》刊发的研究以耐酸酵母Issatchenkia orientalis（又称Pichia kudriavzevii）为对象。研究背景方面，传统模式酵母Saccharomyces cerevisiae为Crabtree阳性，易在好氧下产乙醇；而Issatchenkia orientalis一般为Crabtree阴性，且耐极酸、耐乙酸与糠醛等抑制物，可直接以游离酸形式生产有机酸，省去中和步骤。木质纤维素水解液含40%–50%纤维素源葡萄糖与20%–30%半纤维素源木糖，但绝大多数工业微生物存在碳分解代谢物阻遏（CCR），即使导入木糖还原酶（XR）–木糖醇脱氢酶（XDH）–木酮糖激酶（XK）途径，细胞仍先耗葡萄糖、后耗木糖，导致发酵周期长、代谢脱钩、总产率下降，这是制约木质纤维素生物炼制经济性的核心技术障碍。
研究人员开展的研究包括：评估糖补料顺序、系统解析并单缺/三缺己糖激酶（HXK1、HXK2、HXK3）、在完整与三缺背景下表达异源转运蛋白AtSWEET7与LST1、并通过基因剂量优化获得双拷贝LST1菌株SD108XL-LST2，最后在稻秸秆水解液中验证。结论为：转运水平的“拉动”可绕开天然葡萄糖优势调控，在不破坏糖酵解信号前提下实现混合糖高效共利用；该策略对耐酸酵母有机酸生物制造具有重要意义。
主要关键技术方法：以已构建的乳酸生产菌SD108XL（SD108背景，删pdc与gpd、删ura3、于IS1整合乳酸脱氢酶（LDH）、于IS3整合XR-XDH-XK）为亲本；用CRISPR/Cas9进行HXK基因缺失与基因组位点IS2、IS5整合；异源基因AtSWEET7与LST1做密码子优化后置于内源PTDH3启动子与TMDH1终止子下表达；在定义培养基与酸预处理酶解稻秸秆水解液两类底物中做混合糖发酵；以HPLC与Rezex ROA-Organic Acid H+（8%）柱定量葡萄糖、木糖与乳酸。
3.1 糖补料顺序对葡萄糖–木糖共利用生产乳酸的影响：研究人员通过序批补料发现，葡萄糖先加时木糖后期利用差、特异木糖得率仅0.18 g/g；木糖先加时初期木糖得率达0.52 g/g，总得率0.53 g/g，较同步发酵0.26 g/g高2.04倍。说明初期代谢状态决定后续戊糖利用效率。
3.2 己糖激酶缺失的混合糖发酵系统评价：在单糖与混合糖中，hxk1Δ、hxk2Δ、hxk3Δ均延迟葡萄糖利用但终乳酸滴度与得率提高（0.53 g/g），体积产率降至约0.53 g/L·h；三缺hxk123Δ则葡萄糖与木糖均不消耗，提示己糖激酶介导信号缺失使天然转运系统调控关闭。
3.3 异源糖转运蛋白工程以增强混合糖共利用：在三缺背景表达LST1或AtSWEET7可恢复摄糖，但速率低；在完整SD108XL中，SD108XL-LST1较亲本更早稳利用木糖，得率0.50 g/g、产率0.77 g/L·h；LST1优于AtSWEET7因其为MFS型、交替访问机制、对木糖Km更低且与酵母膜更兼容。双拷贝SD108XL-LST2在约45 g/L葡萄糖+44 g/L木糖中56 h产乳酸53.5 g/L、得率0.63 g/g、产率0.96 g/L·h；稻秸秆水解液中协同效应减弱，归因为粗水解液抑制物影响细胞适合度。
讨论部分总结：研究人员指出，全局调控因子或己糖激酶删除会破坏互作信号网络并产生多效性生长缺陷；而强化LST1这类异源转运蛋白可从“转运拉动”层面抵消葡萄糖优势，不扰乱必需糖酵解信号，为耐酸酵母高效转化木质纤维素糖提供概念验证。
结论部分翻译：本研究界定了混合糖利用中的代谢瓶颈并提出在Issatchenkia orientalis中实现高产有机酸的策略。补料顺序实验表明操作调整只能部分缓解葡萄糖优势，天然碳分解代谢物阻遏（CCR）仍是同步代谢根本障碍。己糖激酶活性遗传削弱虽提高乳酸得率，但带来严重动力学权衡；HXK1、HXK2与HXK3同时中断在测试条件下致严重代谢停滞。关键突破是通过异源表达MFS型转运蛋白LST1，将糖转运与天然调控约束解耦。提高LST1基因剂量且保留内源己糖激酶活性后，终菌株SD108XL-LST2在混合糖下较亲本SD108XL的得率与产率均显著提升。结果表明，强健混合糖利用可通过转运驱动策略实现，该策略绕开天然代谢层级同时保留必需糖酵解信号，为可持续木质纤维素生物炼制提供概念验证。
