一种用于靶向脂滴成像及非酒精性脂肪肝疾病活体可视化的极性敏感荧光探针

《Talanta》：A polarity-sensitive fluorescent probe for targeted lipid droplets imaging and in vivo visualization of non-alcoholic fatty liver disease

　　

摘要

脂滴（LDs）的极性及其丰度与涉及脂质代谢异常的各种病理过程密切相关。脂滴在肝细胞中过度积累会导致肝脏脂质沉积以及非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的发生。因此，监测脂滴数量和极性的变化对于生物医学研究及NAFLD的临床诊断至关重要。然而，开发能够兼具高极性敏感性与明亮发射，适用于活体肝脏成像的脂滴特异性荧光探针仍然是一项重大挑战。本文设计并合成了四种D-π-A结构的化合物（FPLD-1至FPLD-4），并系统评估了它们的极性敏感性。其中，FPLD-2表现出卓越的极性敏感性，且该敏感性独立于溶剂黏度，同时还具有强烈的荧光信号和较大的Stokes位移。细胞实验表明，FPLD-2能够特异性标记脂滴并实现对其动力学的实时监测。此外，FPLD-2在NAFLD小鼠模型的肝脏中产生选择性荧光信号，并清晰地显示了组织切片中的脂滴，从而实现了脂质活体积累的灵敏可视化。这些结果表明，FPLD-2作为一种有前景的探针，可用于研究NAFLD中与脂滴相关的生理和病理过程。

引言

脂滴（LDs）最初被认为是多余脂质的静态储存库[1]。然而，研究的进展已将其重新定义为在脂质和能量稳态中发挥核心作用的动态亚细胞器[2,3]。在结构上，脂滴由中性脂质的疏水核心组成，外围包裹着一层磷脂单层，并装饰有各种相关蛋白[[4], [5], [6]]。在细胞环境中，微环境极性是一个关键的物理化学参数，主导着众多代谢过程[7]。在脂滴中，极性与维持其结构完整性和生物功能密切相关[8,9]。因此，脂滴的大小、丰度和极性的异常改变与多种代谢性疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、肥胖、高血压，尤其是非酒精性脂肪肝病（NAFLD）[[10], [11], [12], [13]]。

肝脏作为全身脂质代谢的核心器官，对于维持全身脂质稳态不可或缺。在生理条件下，肝细胞仅在胞质脂滴中储存有限量的脂质。然而，在NAFLD中，脂滴的过度积累推动了病理性肝脏脂质沉积[[14], [15], [16]]，这是该慢性异质性疾病的标志，并可进展为肝纤维化和肝细胞癌[17,18]。随着全球肥胖患病率的不断上升，NAFLD已成为全球最常见的慢性肝病之一[19,20]。荧光成像因其高灵敏度[21]、优异的时空分辨率以及实时活体成像能力[22]，代表了一种监测脂滴动力学的强有力手段[[23], [24], [25]]。尽管在脂滴成像荧光探针的开发方面取得了相当大的进展[[26], [27], [28]]，但仍存在若干关键局限性。许多传统脂滴靶向探针由于其他细胞器或环境因素的干扰而特异性不足，且在复杂生物条件下极性敏感性不够。尽管已经开发了多种脂滴靶向荧光探针，但其成功应用大多局限于培养细胞，仅有少数延伸至斑马鱼模型或离体组织成像。此外，发射波长较短以及肝脏靶向能力差等缺陷严重限制了其在活体NAFLD成像中的应用[[29], [30], [31]]。因此，迫切需要开发新型脂滴特异性荧光探针，将高保真度极性鉴别与强大的活体成像性能相结合，用于NAFLD的诊断和研究。

为应对这些挑战，我们设计并合成了四种候选探针，即FPLD-1、FPLD-2、FPLD-3和FPLD-4，并系统评估了它们的极性响应特性（方案1）。我们设计了两个系列的荧光探针，FPLD-1和FPLD-2使用经典强受体二氰烯烃作为电子 withdrawing 基团，而FPLD-3和FPLD-4则选择带正电荷的吲哚鎓受体以提高荧光探针的发射波长。供体部分均固定为N-取代苯胺，并保留苯环/噻吩环作为可变的π桥。供体部分保留暴露的羟基，这可以为探针提供良好的脂溶性并提高其对脂滴的特异性响应能力。通过筛选一系列具有梯度极性的溶剂中的荧光行为，FPLD-2成为最佳候选者。该探针具有供体-π-受体（D-π-A）结构，有利于强分子内电荷转移（ICT）。体外表征表明，FPLD-2表现出强烈的荧光发射信号和高极性敏感性，特别是在低极性环境中表现突出。细胞实验进一步证实了其对脂滴的优异特异性以及监测脂滴实时动力学和积累变化的能力。重要的是，在NAFLD小鼠模型中，FPLD-2在肝脏内产生强烈的荧光信号，能够清晰地区分健康状态和疾病状态，并在NAFLD组织切片中展现出精确的脂滴定位能力。综上所述，这些结果确立了FPLD-2作为一种有前景的极性响应探针，可用于脂滴的靶向成像，以及研究脂滴相关疾病的宝贵工具，尤其对NAFLD具有重要意义。本研究还可能为设计高级发光材料以更广泛地应用于生物医学领域提供新的见解。

各部分摘要

合成与表征

FPLD-X的详细合成步骤和表征方法见支持信息（图S18–S29）。

细胞培养与荧光成像

HepG-2和HeLa细胞在含有10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在37°C、含5% CO₂的湿润大气中培养。对于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像，将细胞接种于玻璃底培养皿中并培养

溶剂极性敏感探针的体外荧光筛选

为建立支配极性响应性的结构-性质关系，系统考察了FPLD-1至FPLD-4在一组具有梯度极性的溶剂中的光物理行为（图1和图S1）。同时，我们在表S1中计算了四种化合物在不同溶剂中的荧光量子产率、摩尔吸收系数及其他相关物理性质参数。如图1所示，所有四种化合物均表现出

结论

总之，我们设计并合成了四种D-π-A结构的化合物（FPLD-1-4），并系统表征了它们的极性响应荧光性质。结合理论计算和溶剂色移研究确定了FPLD-2为最佳候选者，表现出显著的ICT效应、高极性敏感性和大的Stokes位移。FPLD-2表现出低细胞毒性和对脂滴的高特异性，能够在体内实时监测脂滴的动力学和丰度变化

CRediT作者贡献声明

刘嘉天：初稿撰写、方法学、调查研究、数据整理。李震鹏：方法学、调查研究、数据整理。莫山延：可视化、验证、方法学。袁青：可视化、验证、方法学。戴吉敏：验证、方法学、数据整理。苏东东：论文审阅与编辑、可视化、指导监督、方法学、基金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知经济利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（编号22574006、22274005）和北京自然科学基金（编号7244301）的支持。

刘嘉天|李震鹏|莫山延|袁青|戴吉敏|苏东东

北京工业大学 化工与生命科学学院 化学系，北京，100124，中国