基于便携式拉曼 SERS 与深度学习的多种响应指标智能表征的水稻镉胁迫早期诊断

《Talanta》：Early Diagnosis of Cadmium Stress in Rice by Intelligent Profiling of multiple response indicators with portable Raman SERS and Deep Learning

　　

摘要
镉污染严重影响水稻的生长、产量和品质，因此早期胁迫监测对于农业管理和食品安全至关重要。然而，传统检测方法操作繁琐、耗时较长，限制了其在早期胁迫诊断中的应用。本研究开发了一种快速、准确的方法，用于判别水稻的镉胁迫水平。我们合成了精氨酸修饰的花状银纳米颗粒（Ag NPs-Arg），以增强与三种胁迫响应指标相关的拉曼信号：水杨酸（SA）、丙二醛（MDA）和过氧化物酶（POD）活性。在此基础上，建立了这些生理指标的量测预测模型以及胁迫水平判别模型。在所评估的模型中，CNN-Transformer模型取得了最佳的预测性能，SA、MDA和POD活性的Rp2值分别为0.889、0.832和0.802。采用客观赋权方法对三种生化参考指标进行整合，为综合胁迫评估提供了多指标生理学依据。所建立的胁迫水平评估模型准确率达95.83%，展现了其捕捉镉诱导的生理变化并评估水稻胁迫水平的能力。

引言
近年来，镉污染仍是一个严峻的全球性问题，呈现出持续积累和复合污染的态势1。镉（Cd）是一种具有高生物毒性的重金属元素。随着工业、矿业和农业的快速发展，其在环境中的积累日益严重，通过灌溉和大气沉降等途径进入农业生态系统2。水稻作为全球超过半数人口的主食，其独特的淹水生长环境赋予其根系对土壤中镉的显著吸收和富集能力3。这导致"镉污染稻米"事件频发，不仅严重制约了水稻产业的可持续发展，也对农产品质量安全和人类健康构成直接威胁4。

镉被水稻根系吸收后，会引发一系列复杂的生理胁迫响应5。在细胞水平上，镉扰乱必需元素的吸收，破坏叶绿体结构，抑制光合作用，并诱导活性氧（ROS）爆发。ROS爆发会导致膜脂过氧化、蛋白质变性和核酸损伤6。为对抗这种氧化胁迫，水稻激活其内源性防御系统，包括合成水杨酸等信号分子以调节胁迫响应基因的表达，以及增强过氧化物酶等保护酶的活性以清除ROS7。值得注意的是，外源施用水杨酸已被证明能通过多条途径有效缓解镉诱导的氧化损伤并提高水稻的镉耐受性，这些途径包括增强植物自身的抗氧化防御系统、调节镉离子转运以及稳定细胞膜结构8。在这些响应中，水杨酸、丙二醛和过氧化物酶动态变化作为揭示水稻镉胁迫早期响应和损伤程度的关键生理指标9。

目前检测植物镉胁迫的方法主要包括实验室化学分析、高光谱成像和可见-近红外（Vis-NIR）光谱。例如，Yang等人采用基于菠菜生理响应机制的高光谱成像方法，结合具有多个卷积分支的Cd-SpiNet提取镉特异性光谱特征，以准确量化叶片中的镉含量。该方法增强了模型对镉相关信号的敏感性，在测试集上达到了0.9753的决定系数（R2）和0.0287 mg/kg的预测均方根误差（RMSEP）10。同样，Zhou等人开发了一个预测生菜叶片镉含量的模型，通过检测和在不同胁迫水平下分析Vis-NIR反射光谱及相应的叶片镉浓度。他们的模型在测试数据集上得到了0.92的决定系数和1.53 mg/kg的RMSEP，展示了Vis-NIR光谱在监测生菜镉污染方面的巨大潜力11。在另一项研究中，Shi等人将荧光高光谱成像（FHSI）与近红外光谱相结合，用于生菜叶片镉的非破坏性检测。他们使用FHSI系统采集荧光高光谱图像，并使用光谱仪获取近红外光谱。随后，结合基于CNN的融合光谱特征与LSSVR的模型达到了最佳预测效果，Rp2和RMSEP值分别为0.9044和0.0255 mg/kg12。

与实验室化学分析不同，这些光谱技术无需繁琐的操作程序，也不会对植物样品造成损伤，为快速、非破坏性和实时植物胁迫检测奠定了坚实基础。然而，它们也面临挑战：高光谱成像涉及大规模计算数据集，早期胁迫信号往往较弱且易被噪声掩盖，而Vis-NIR光谱的精度通常低于高光谱方法。

表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种新兴的光学分析技术，具有高度灵敏度、强指纹识别能力13、样品需求量少以及适合原位检测等突出优势，已广泛应用于环境污染物检测和生物分子分析14, 15。值得注意的是，该技术在植物胁迫监测领域展现出独特潜力16。通过设计和制备高性能SERS活性基底，可以显著增强植物内低浓度生物分子的拉曼信号17, 18，从而有可能原位捕捉细微的早期生理信号变化19。近年来，相关研究已成功从标准样品检测拓展到植物叶片和根系等实际标本20, 21。

例如，Son等人制备了一种SERS纳米探针，能够透过气孔进入细胞间隙以监测植物中的胁迫响应分子。该方法用于对活体植物中与胁迫相关的内源分子（如水杨酸、细胞外ATP和谷胱甘肽）进行实时检测，从而实现了对关键胁迫响应分子的实时乃至活体监测22。在另一项研究中，Zhang等人开发了一种基于SERS的脱落酸（ABA）适配体传感器。利用ABA适配体与其互补链之间的特异性识别，检测灵敏度得到了显著提高，达到了0.67 fM的超低检测限。该方法成功应用于检测小麦叶片中的ABA含量，与酶联免疫吸附测定（ELISA）结果相比，相对误差（RE）在5.43%至8.94%之间19。同时，SERS技术与新型纳米传感器（如微针贴片）和便携式设备的集成23, 24，正推动植物健康诊断向智能化和现场部署化方向发展25。

然而，目前SERS在植物胁迫研究中的应用主要停留在单个植物样品中特定分子的静态检测阶段，尚未建立涵盖整个胁迫过程的系统性综合分析框架26, 27。此外，基于SERS光谱同时构建胁迫水平判别模型和胁迫响应分子量测预测模型的系统性研究较为匮乏。总体而言，当前技术水平仍主要处于"样品检测"阶段，距离实现植物胁迫全周期的整体性、系统性和模型驱动的监测与健康诊断仍存在显著差距28。

在此基础上，本研究旨在构建基于花状Ag NPs-Arg的SERS传感平台，并将其与多种机器学习模型集成，实现对水稻镉胁迫响应过程中水杨酸、丙二醛和过氧化物酶等关键生理指标的时间序列动态监测与定量分析。本研究旨在为水稻镉胁迫早期诊断和胁迫耐受性研究提供一种新颖可靠的技术方法。本文的主要贡献如下：（1）建立了基于花状Ag NPs-Arg的高性能SERS传感平台。该平台实现了对水稻镉胁迫相关关键生理生物标志物（水杨酸、丙二醛、过氧化物酶）的高灵敏检测，为捕捉低浓度胁迫信号提供了可靠方法。（2）构建了不同生理指标的高精度定量预测模型。利用获取的SERS光谱数据，分别采用偏最小二乘回归（PLSR）、支持向量机（SVM）和CNN-Transformer混合模型建立定量预测模型。这些模型有效实现了对各分子在整个胁迫过程中动态变化的精确跟踪和分析。（3）开发了基于多指标综合分析的胁迫水平判别模型。通过深度整合三种生理指标（水杨酸、丙二醛和过氧化物酶）的监测信息，构建了镉胁迫水平判别模型，实现了对水稻镉胁迫严重程度的系统评估和早期预警，从而提高了诊断的全面性和可靠性。最终，本研究建立了水稻镉胁迫时间序列监测与智能诊断的综合体系，为植物胁迫生理研究和精准管理提供了创新的系统性解决方案。

章节片段

水稻种植
本实验使用的水稻品种为Oryza sativa L.（粳稻）。实验处理中施用的外源水杨酸为分析纯试剂，分子式为C7H6O3；镉以分析纯试剂CdCl2·2.5H2O形式提供。OSD1-OE品系（高水平SA）和osd1突变体（低水平SA）均在粳稻（Nipponbare）背景下构建，由浙江师范大学生命科学学院提供。OSD1-OE和osd1的种子被用作独立……

不同镉胁迫水平下水稻幼苗的表型变化
如图3所示，水稻幼苗在长期镉胁迫暴露下表现出典型且渐进的毒性表型。在胁迫初期（第0天至第3天），与对照组相比，处理组幼苗未见明显矮化，但叶片上已开始出现轻微的黄化现象。到第6天，毒性效应更加明显，幼苗生长受到显著抑制，表现为株高显著降低……

讨论
本研究开发了一种结合Ag NPs-Arg增强SERS策略与机器学习模型的方法，用于监测水稻镉胁迫相关的生理响应。利用SERS光谱特征对SA和MDA含量进行定量预测，并间接估算POD活性，同时将整合的生理信息纳入多指标胁迫评估模型。结果证明了将SERS光谱……

结论
本研究旨在建立一种快速基于SERS的水稻镉胁迫评估方法。通过构建花状Ag NPs-Arg作为SERS活性基底，显著增强了水稻叶片中关键生理胁迫指标的拉曼信号，实现了对SA和MDA含量的预测以及对POD活性的间接估算。实验结果表明，PLSR、SVM和CNN-Transformer模型均能够预测这些……

CRediT作者贡献声明
LeiLei Zhang（张磊磊）：撰写——审阅与编辑、项目管理、资金获取、概念化。Ting Wu（吴婷）：撰写——初稿、方法学、数据整理。Yanfei Ding（丁雁飞）：方法学、数据整理。Yutong Gao（高远通）：验证、软件。Hongwei Sun（孙宏伟）：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。Fan Tang（唐帆）：验证、正式分析。Qianwen Zhao（赵千雯）：数据整理。Qiong Jiang（蒋琼）：撰写——审阅与编辑。Chenze Lu（陆晨泽）：调查研究、正式分析。Cheng Zhu（朱诚）：监督、……

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢
本项目受国家自然科学基金（编号32402204）、国家自然科学基金（编号32572263）、国家大学生创新创业训练计划（编号202510356001）及浙江省"尖兵""领雁"研发攻关计划（编号2022C04002）资助。

Ting Wu | LeiLei Zhang | Yanfei Ding | Hongwei Sun | Yutong Gao | Qianwen Zhao | Fan Tang | Chenze Lu | Qiong Jiang | Cheng Zhu

浙江省特色农产品质量与危害控制技术重点实验室，中国计量大学生命科学院，杭州 310018，中国