SCAN：一种用于现场病毒检测的样本到答案交叉引物等温检测方法，兼具RT-qPCR的灵敏度与基因组相似病毒的鉴别特异性

《Talanta》：SCAN: A sample-to-answer cross-priming isothermal assay for on-site virus detection with RT-qPCR sensitivity and genomically similar virus differentiation specificity

　　

摘要

基因组相似的病毒常因特定突变而在致病性和宿主嗜性方面存在差异，若无法对其进行区分，则可能导致误诊和控制措施无效。分子方法可以区分此类病毒，但需要实验室环境和专业操作人员；而可部署于现场的免疫学方法则存在交叉反应的问题。为应对这一挑战，我们开发了SCAN（样本至结果交叉引物等温扩增核酸试纸条），这是一种用于现场检测基因组相似病毒通用框架。通过分离与测序数据的比较生物信息学分析，识别关键的保守差异决定子以进行引物设计，确保特异性并减少非特异性扩增。单管交叉引物等温扩增（CPA）能够在无需热循环的情况下快速扩增靶标，扩增产物通过核酸试纸条进行可视化检测。所有步骤均集成于一体式手持轻便设备（9.9 × 4.4 × 3.3 cm，<200 g）中，同时有效防止气溶胶污染。本研究以传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV，TGEV的天然突变体）为模型，SCAN的检测限达到10²拷贝/μL，灵敏度与RT-qPCR相当，支持80分钟内完成"样本至结果"检测及简单操作。经验证的高灵敏度、特异性和准确性以及现场适用性，SCAN为开发需要精确现场区分密切相关病原体的即时检测（PoCT）提供了可推广的路径。

引言

许多病毒在基因组水平上高度同源，尤其是进化相关的毒株之间[[1], [2], [3]]。然而，即使是微小的遗传变化，如核苷酸替换、缺失或其他局部突变，也可能通过改变受体结合、细胞入侵、复制适应性和免疫/宿主互作等相关决定子而深刻影响病毒的生物学功能，从而重塑组织嗜性和致病性[4,5]。因此，基因相似的病毒可能导致截然不同的临床结局和传播动态。如果这些密切相关的病毒未被准确区分，诊断交叉反应可能导致假阳性分类或不适当的病毒归属，这不仅会导致临床误诊，还可能引发流行病学误判和次优决策[6,7]。此类错误可能导致高估或低估暴发严重性、风险评估不准确以及预防控制策略不当，最终造成资源浪费并可能损害根除计划的效果。这些考量凸显了开发具有高分辨特异性的检测方法来区分TGEV和PRCV等密切相关冠状病毒的必要性。

TGEV和PRCV均属于冠状病毒科，PRCV是TGEV的天然突变体。两者基因组高度同源，但临床致病性截然不同[[8], [9], [10]]。TGEV主要感染猪肠道上皮细胞，引起严重呕吐、水样腹泻和高死亡率（尤其是仔猪，死亡率可达100%）[[11], [12], [13]]。相比之下，由于S基因的缺失突变，PRCV丧失了肠道嗜性，转而感染呼吸道，仅引起轻微或亚临床呼吸道症状，造成的直接生产损失相对较小[[14], [15], [16]]。如果检测方法将PRCV阳性个体误判为TGEV感染，可能导致对暴发严重性的过高估计，从而触发不必要的控制措施，如隔离、扑杀或过度疫苗接种，造成资源浪费和经济负担[17]。因此，开发能够特异性检测TGEV并避免PRCV交叉反应的检测技术具有重要意义。

目前，能够区分TGEV和PRCV的方法主要依赖常规RT-PCR和RT-qPCR。这些方法通过针对PRCV缺失区域设计引物或探针，并依赖扩增子大小或荧光信号来实现区分[[18], [19], [20]]。然而，此类方法需要精密仪器、专业操作人员和实验室环境，无法在养猪场的现场条件下即时完成，从而限制了其在基层快速诊断中的应用[21]。相比之下，常见的现场检测工具，如免疫层析试纸条（如胶体金试纸条），操作简单、无需仪器，可在15分钟内出结果。然而，由于TGEV和PRCV间某些表位高度同源，现有抗体无法有效区分这两种病毒，常导致试纸条出现交叉阳性反应[22,23]。因此，这些试纸条同样无法实现对TGEV的特异性现场鉴定。总之，常规分子方法虽能区分此类密切相关病毒，但受限于复杂操作和昂贵仪器，不适合现场使用；免疫学方法适用于现场检测，但无法区分TGEV和PRCV这样高度相似的病毒。因此，能够特异性鉴定TGEV并排除PRCV的现场检测仍具挑战性。

为应对这一挑战，我们提出了样本至结果交叉引物等温扩增核酸试纸条（SCAN）。SCAN是一种PoCT检测，靶向PRCV S基因缺失边界内的TGEV特异性区域，采用单管CPA，具有简单引物设计和快速动力学扩增，并通过核酸试纸条实现简单读取，如图1所示。本研究的创新之处在于三个方面。第一，基于比较生物信息学的理性靶标选择策略。针对TGEV和PRCV序列高度同源的挑战，本研究通过分离和全基因组测序获取病毒遗传信息。如图1A所示，对多个TGEV和PRCV毒株的生物信息学比较识别出S蛋白为其差异的关键决定子。比对S蛋白序列后，选取高度保守区域作为CPA引物靶标，确保特异性并最大限度减少非特异性扩增。第二，灵敏度与RT-qPCR相当的单管CPA系统，无需热循环，并通过侧向流试纸条进行可视化检测。本研究设计了单管CPA系统，这是一种使用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的快速等温核酸扩增技术。在此单管格式中，所有组分，包括五个功能性引物（交叉引物2a1s、检测引物2a和3a、置换引物4s和5a）、Bst DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、逆转录酶、MgSO₄和甜菜碱等，均预先混合在单一反应管中。加入样本后，反应在恒定温度下直接进行，无需任何分步操作或温度循环。五个引物协同作用，在同一管中实现高效靶标扩增。为进行核酸试纸条上的可视化检测，我们在检测引物的5′端标记了生物素和FITC。扩增产物形成FITC@dsDNA@Bio复合物（图1B），该复合物与结合垫上的乳胶微球标记的抗FITC抗体结合，形成乳胶微球@Ab-FITC@dsDNA@Bio复合物。这些复合物迁移至检测线（T线），其中固定的抗Bio抗体捕获它们并产生可见条带。未结合的复合物继续迁移至质控线（C线），并与预包被的羊抗鼠抗体结合，产生第二条带用于结果判读，如图1C所示。第三，紧凑型手持集成设备，能够在80分钟内完成完整的"样本至结果"操作并有效防止气溶胶污染。图1D所示的SCAN设备将单管CPA和核酸试纸条检测集成于一体式手持平台，尺寸仅为9.9 × 4.4 × 3.3 cm，重量<200 g，为样本至结果的PoCT提供了解决方案。由于SCAN设备采用单管反应，它还避免了核酸气溶胶污染，这是等温扩增技术的常见缺陷。所提出的SCAN为TGEV提供了灵敏、简便、快速的现场诊断方法，同时有效排除PRCV，从而实现急性传染病的精确监测，改善防控效果。重要的是，除这一具体案例外，我们的策略为区分基因组高度同源但致病表型不同的密切相关病毒谱系提供了可推广的范式，为新兴或再兴病毒威胁的准确诊断和监测提供了多用途平台。

章节摘要

材料和试剂

TGEV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）及粪便样本均购自中国山西农业大学动物科技学院。2× Taq Master Mix、Bst II Pro DNA聚合酶大片段、RTv逆转录酶、小鼠RNase抑制剂、dNTP混合物、荧光染料、一步法RT-qPCR Super PreMix及Hiscript II 第一链cDNA合成试剂盒均购自Vazyme（南京，

TGEV的分离和鉴定

经连续盲传后，ST细胞表现出明显的细胞病变效应（CPE），特征为细胞变圆、融合和部分脱落（图2A）。PCR（图2B）和IFA（图2C）均呈阳性结果，确认分离到的病毒为TGEV。详细分析见补充结果S4。

TGEV的全基因组扩增和遗传进化分析

使用9对TGEV特异性引物，从TGEV病毒液中扩增出9个片段（图2D）。双向测序和拼接获得了完整的CDS，共28,366

讨论与结论

区分TGEV与PRCV的核心意义在于避免因抗原交叉反应导致的误诊，从而实现精准的防控策略。PRCV是TGEV的自然基因缺失突变体。两种病毒血清学高度相似但致病性差异巨大[28,29]。在自然界中，存在多对类似于TGEV/PRCV的病毒对。这些病毒对要么源自共同祖先病毒，要么代表不同的

作者贡献声明

姬树森：写作 – 原稿、可视化、验证、方法论、调查研究、形式分析。马莉：写作 – 原稿、验证、方法论。杨俊杰：软件、调查研究、数据管理。魏贤：验证、方法论。李博雅：可视化、调查研究、形式分析。何倩：可视化、调查研究、形式分析。张元昌：验证、软件。侯伟：验证、调查研究。王寿宇：写作 – 审阅与编辑、监督，

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本文报告工作的情况。

致谢

本研究得到山西省动物疾病研究重点实验室平台项目、预防与控制（项目编号：202504010931010）、山西省三晋人才支持计划（编号：SJYC2024032）以及晋中国家农业高新区科技创新项目的资助。

姬树森|马莉|杨俊杰|魏贤|李博雅|何倩|张元昌|侯伟|王寿宇|王斌|王海冬