酸中毒通过将富含SR的剪接因子隔离在核散斑中促进外显子跳跃

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Acidosis promotes exon skipping through sequestering SR-rich splicing factors in nuclear speckles

　　

选择性剪接（alternative splicing, AS）的失调长期以来一直与以急性或慢性酸中毒为特征的侵袭性癌症表型相关。近期有假说认为，这种失调源于富含SR的剪接因子（SR-rich splicing factors）在核散斑（nuclear speckles）中的隔离。然而，该假说缺乏实验证据。在此，研究人员证明，在与酸中毒一致的pH范围内，磷酸化的富含SR的剪接因子片段在核散斑的最小及多组分模型中发生相变（phase transition）。这种酸化效应类似于SR去磷酸化的效应。研究人员解释了该效应的分子基础，并在酸化的人体细胞中观察到了核散斑的类似转变。研究人员还分析了响应于长期酸化的剪接改变。最常见的改变是外显子跳跃（exon skipping），这与正常情况下促进外显子包含的富含SR剪接因子的不可及性一致。研究结果支持了先前提出的假说，并加深了对剪接调控的理解。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

选择性剪接（alternative splicing, AS）是真核生物基因表达调控的重要机制，其失调已被广泛认为是癌症的标志性特征之一。异常的AS模式可产生促进肿瘤增殖、侵袭和转移的蛋白质异构体，因此寻找驱动AS失调的内源性因素及针对剪接机器的新治疗靶点成为癌症研究的热点。在众多被认为可能导致AS失调的代谢因素中，酸中毒（acidosis）因其与侵袭性癌症表型的密切关联而尤为突出。肿瘤微环境中的代谢失衡常导致细胞外及细胞内pH值下降，形成酸中毒状态，这种状态被认为可能通过影响剪接因子的功能来重塑AS景观。

然而，此前关于酸中毒对AS影响的研究缺乏特异性证据，即酸中毒究竟是特异性地影响选择性剪接，还是对组成性剪接（constitutive splicing）也有影响，尚不明确。AS的调控依赖于剪接位点选择对顺式调控元件（如外显子剪接增强子ESE或内含子剪接沉默子ISS）和反式调控因子（如富含SR的剪接因子SRSFs和异质性核糖核蛋白hnRNPs）的依赖。SRSF家族蛋白的特征是含有一个富含SR的低复杂度区域（low complexity region, LCR），该区域可结合前剪接体复合物E并促进其向功能性复合物A/B/C转变，从而促进外显子包含；而hnRNP家族蛋白则通常结合内含子区域，抑制剪接体组装，促进外显子跳跃或内含子保留。

SRSF的活性受翻译后修饰（尤其是丝氨酸磷酸化）的严格调控。磷酸化激活SRSF以结合剪接复合物，而去磷酸化则使其参与mRNA出核和翻译起始。在细胞间期，部分磷酸化的SRSF与hnRNPs、RNA及小核核糖核蛋白（snRNPs）共同发生液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS），形成松散且形状不规则的核散斑（nuclear speckles）。核散斑的核心由SRSF支架构成，外周富集hnRNPs和剪接体组分。此前有假说认为，酸中毒可能通过改变SRSF的净电荷密度（net charge per residue, NCPR）和电荷块状度（blockiness of charge, BLC）来促进SRSF的相分离或固化，从而重塑核散斑，但其缺乏直接的实验证据。

本研究旨在阐明肿瘤微环境中特征性的中度酸化是否影响核散斑，以及该效应是否类似于SRSF去磷酸化，并进一步表征其对AS的后果。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过体外重构模型、细胞实验和转录组分析，系统验证了酸中毒诱导核散斑重塑并导致外显子跳跃的假说。研究得出以下主要结论：在与酸中毒一致的pH范围内（6.0–7.4），磷酸化的SR-rich片段（phospho-SR）在RNA存在下发生相变，其效应类似于SR去磷酸化；酸化使核散斑变得更小、更圆、更粘稠，即发生固化；长期酸化诱导的AS改变中最常见的是外显子跳跃，这与SRSF被隔离在核散斑中而无法接近外显子剪接增强子（ESE）的机制一致。

三、关键技术与方法

研究人员采用了多种关键技术方法：利用体外重构的最小及多组分核散斑模型，通过浊度测定（turbidimetry）、荧光显微镜、荧光漂白后恢复（FRAP）和被动微流变学（passive microrheology）表征相分离效率、液滴形态、组分流动性及粘度；使用pH敏感型核酸传感器FAM-C₅T^propyl-TAMRA结合离子载体处理模拟急性酸中毒，并通过免疫荧光染色（抗SRRM2/SRSF2抗体、抗SF3B1抗体）分析核散斑形态；采用长期轻度酸化（pH 6.6）模型结合SR蛋白激酶抑制剂SRPIN340处理，通过RNA测序（RNA-seq）和定量RT-PCR分析转录组及AS变化。样本来源为HEK-293人胚胎肾细胞和SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞。

四、研究结果

1. 酸化诱导磷酸化SRSF片段在RNA存在下发生相分离

研究人员选取含三个磷酸化位点的SRSF1片段（phospho-SR）及其去磷酸化（dephospho-SR）和磷酸模拟突变（mutant-SR）对照肽，在含RNA的缓冲液中分析pH对其相分离的影响。结果显示，phospho-SR在pH 7.4时相分离效率较低，而在pH 6.0时显著增强，其行为接近dephospho-SR；mutant-SR因谷氨酸侧链在生理pH范围内始终去质子化，其相分离行为在pH 6.0–7.4间无明显变化。这些结果与NCPR和BLC的预测曲线一致，表明磷酸丝氨酸（S^p）的质子化（pKa约5.8）是介导酸化诱导相变的关键因素。

2. 酸化改变phospho-SRSF与hnRNP A1的共分离并重塑核散斑

在含phospho-SR、hnRNP A1和RNA的多组分模型中，pH 6.0条件下形成的液滴比pH 7.2时更小、更圆、更粘稠。FRAP实验显示，酸化显著降低了phospho-SR的荧光恢复速率（tau^1/2从20 ± 1 s增至34 ± 1 s），而对hnRNP A1的影响较小；被动微流变学实验也证实pH 6.0时液滴内微球扩散系数显著低于pH 7.2。在细胞层面，急性酸化（pH 6.0，30分钟）使HEK-293和SH-SY5Y细胞中核散斑的中位面积显著减小（约17%–50%），圆形度显著增加（约7%–40%），表明核散斑发生固化。

3. 酸化影响选择性剪接，促进SRSF敏感的外显子跳跃

长期酸化（pH 6.6，48小时）的HEK-293细胞RNA-seq分析显示，外显子跳跃（SE）是酸化调控的最常见AS事件，占所有差异AS事件的61%（其中50%为跳跃增加，11%为跳跃减少），涉及6086个基因；内含子保留（RI）次之，占16%。功能富集分析表明，受酸化影响的基因富集于细胞周期检查点/增殖相关通路和pre-mRNA加工相关通路。定量RT-PCR验证了TRIM59、FGF5、SEMA6D和CTNND1等基因的外显子跳跃在酸化条件下显著增加。对161个酸化和SRPIN340共同调控的跳跃外显子进行基序分析发现，这些外显子中SRSF结合基序的频率显著低于相邻组成性外显子，提示其对SRSF隔离的敏感性更高。

五、讨论与结论

讨论部分指出，酸中毒通过质子化SRSF的磷酸丝氨酸残基，模拟去磷酸化效应，促进SRSF在核散斑中的固化，从而减少其与外显子剪接增强子的结合，导致外显子跳跃增加。该机制与SR蛋白激酶抑制剂SRPIN340的作用部分重叠但不完全一致，反映了激酶网络的复杂性。研究也承认了其局限性，包括体外模型简化、仅使用HEK-293细胞进行转录组分析等。研究结论支持了酸中毒通过隔离SR-rich剪接因子于核散斑中而促进外显子跳跃的假说，加深了对剪接调控机制的理解，并为癌症治疗中联合靶向SR蛋白激酶与调节肿瘤微环境pH提供了潜在思路。该论文发表在《Frontiers in Molecular Biosciences》。