PCRpanel: 用于靶向扩增子测序的超高多重 PCR 组合自动化设计

《BMC Bioinformatics》：PCRpanel: automated design of ultra-multiplex PCR panels for targeted amplicon sequencing

　　

摘要

背景

超高复孔PCR已成为分子生物学和临床遗传学中靶向扩增子测序的必需手段。

方法

我们开发了PCRpanel，这是一个命令行Java应用程序，配有辅助网页界面，能够联合优化引物热力学性质、语言序列复杂性、引物-二聚体相互作用以及复孔感知的、参考基因组引导的特异性和重复序列屏蔽，以实现自动化超高复孔面板设计。我们在计算机模拟中将PCRpanel与NGS-PrimerPlex和Olivar进行了基准比较，并通过实验设计覆盖COL4A3、COL4A4、COL4A5和COL4A6全部外显子区域的平铺引物池，对四份阿尔波特综合征临床样本的DNA进行扩增来验证其性能。由于这是旨在初步验证设计的试点运行，测序结果仅报告了一位代表性患者样本的数据，其中每个引物池单独扩增并在两种模板稀释度下进行测序，在Illumina MiSeq平台上共获得14个文库；池1.1在方案优化过程中作为50-引物子池运行。读取片段使用DRAGEN Bio-IT Platform v4.4.4比对至GRCh38参考基因组，覆盖度基于源自GENCODE v49的外显子限定目标区间45,372 bp进行量化。关闭了重复标记功能，因为由同一引物对产生的扩增子分子在位置上与PCR重复片段无法区分。

结果

本文介绍了PCRpanel，这是一款用于短读和长读扩增子测序中热力学优化引物面板自动设计的命令行Java应用程序。PCRpanel支持从简单的双引物检测到包含数百个扩增子的超高复孔设计的各种工作流，可适应从完整病毒基因组、真核基因家族到结构变异断点和环境宏基因组等各类靶标。该软件联合优化序列复杂性、热力学稳定性、引物-二聚体相互作用和非靶标扩增，即使在重复或同源区域也能实现稳健的引物选择。高效算法可在标准硬件上于数秒至数分钟内生成超高复孔面板，当对完整人类参考基因组进行筛选时最长可达15分钟，并支持跨同源基因家族的特异性基因设计和通用设计。

结论

我们通过设计237对引物（共474条引物）靶向已确定的三种阿尔波特综合征基因COL4A3、COL4A4和COL4A5的全部外显子区域，以及邻近的COL4A6，来验证该方法。四份阿尔波特综合征临床DNA样本的实验验证确认了全部237对引物的成功扩增。由于这是试点运行，我们对一位代表性患者样本进行测序，其中每个引物池单独扩增并在两种模板稀释度下进行测序作为14个文库（池1.1在方案优化过程中作为50-引物子池），用于评估分析性能：读取比对率为94.2–99.3%，77.8–96.1%的比对读取片段落入外显子目标范围内，每个文库的平均目标深度为149.1-273.7x，获得扩增子覆盖的目标碱基测序深度远高于基因分型所需的阈值（97.9–100%的碱基在≥20x深度下同时也达到了≥50x）。由于每个文库仅携带单一引物池，归一化至完整四基因目标的覆盖广度反映的是该分组设计而非扩增性能；与每个池设计的预期覆盖足迹相比，每个文库≥1×覆盖的足迹对应约60–130%。模拟外显子覆盖率为：COL4A3为65.6%，COL4A4为41.4%，COL4A6为64.4%。对于COL4A5，在存档面板所使用的扩增子大小窗口和全基因组特异性筛选条件下，覆盖率为30.8%的外显子碱基；1,688次系统性设计扫描在完整强制重复屏蔽且省略全基因组特异性筛选的单一配置下，将覆盖率提升至外显子目标的92.8%，并在扫描中跨越所有53个外显子布置了扩增子（补充表S6b），因此这一差距反映的是存档面板所用参数连同该筛选条件，而非方法的局限性。我们提供了一种逐步填补空白的程序，该程序将重新设计限制在未被覆盖的区间内，并在二聚体控制下将补救引物合并入面板，以便在明确的非靶标风险下恢复此类区域。因此，PCRpanel为超高复孔PCR面板构建提供了一种可扩展、平台无关的解决方案，支持研究和诊断场景中的精确且可重复的靶向测序。

图形摘要

背景

超高复孔PCR已成为分子生物学和临床遗传学中靶向扩增子测序的必需手段。

方法

我们开发了PCRpanel，这是一个命令行Java应用程序，配有辅助网页界面，能够联合优化引物热力学性质、语言序列复杂性、引物-二聚体相互作用以及复孔感知的、参考基因组引导的特异性和重复序列屏蔽，以实现自动化超高复孔面板设计。我们在计算机模拟中将PCRpanel与NGS-PrimerPlex和Olivar进行了基准比较，并通过实验设计覆盖COL4A3、COL4A4、COL4A5和COL4A6全部外显子区域的平铺引物池，对四份阿尔波特综合征临床样本的DNA进行扩增来验证其性能。由于这是旨在初步验证设计的试点运行，测序结果仅报告了一位代表性患者样本的数据，其中每个引物池单独扩增并在两种模板稀释度下进行测序，在Illumina MiSeq平台上共获得14个文库；池1.1在方案优化过程中作为50-引物子池运行。读取片段使用DRAGEN Bio-IT Platform v4.4.4比对至GRCh38参考基因组，覆盖度基于源自GENCODE v49的外显子限定目标区间45,372 bp进行量化。关闭了重复标记功能，因为由同一引物对产生的扩增子分子在位置上与PCR重复片段无法区分。

结果

本文介绍了PCRpanel，这是一款用于短读和长读扩增子测序中热力学优化引物面板自动设计的命令行Java应用程序。PCRpanel支持从简单的双引物检测到包含数百个扩增子的超高复孔设计的各种工作流，可适应从完整病毒基因组、真核基因家族到结构变异断点和环境宏基因组等各类靶标。该软件联合优化序列复杂性、热力学稳定性、引物-二聚体相互作用和非靶标扩增，即使在重复或同源区域也能实现稳健的引物选择。高效算法可在标准硬件上于数秒至数分钟内生成超高复孔面板，当对完整人类参考基因组进行筛选时最长可达15分钟，并支持跨同源基因家族的特异性基因设计和通用设计。

结论

我们通过设计237对引物（共474条引物）靶向已确定的三种阿尔波特综合征基因COL4A3、COL4A4和COL4A5的全部外显子区域，以及邻近的COL4A6，来验证该方法。四份阿尔波特综合征临床DNA样本的实验验证确认了全部237对引物的成功扩增。由于这是试点运行，我们对一位代表性患者样本进行测序，其中每个引物池单独扩增并在两种模板稀释度下进行测序作为14个文库（池1.1在方案优化过程中作为50-引物子池），用于评估分析性能：读取比对率为94.2–99.3%，77.8–96.1%的比对读取片段落入外显子目标范围内，每个文库的平均目标深度为149.1-273.7x，获得扩增子覆盖的目标碱基测序深度远高于基因分型所需的阈值（97.9–100%的碱基在≥20x深度下同时也达到了≥50x）。由于每个文库仅携带单一引物池，归一化至完整四基因目标的覆盖广度反映的是该分组设计而非扩增性能；与每个池设计的预期覆盖足迹相比，每个文库≥1×覆盖的足迹对应约60–130%。模拟外显子覆盖率为：COL4A3为65.6%，COL4A4为41.4%，COL4A6为64.4%。对于COL4A5，在存档面板所使用的扩增子大小窗口和全基因组特异性筛选条件下，覆盖率为30.8%的外显子碱基；1,688次系统性设计扫描在完整强制重复屏蔽且省略全基因组特异性筛选的单一配置下，将覆盖率提升至外显子目标的92.8%，并在扫描中跨越所有53个外显子布置了扩增子（补充表S6b），因此这一差距反映的是存档面板所用参数连同该筛选条件，而非方法的局限性。我们提供了一种逐步填补空白的程序，该程序将重新设计限制在未被覆盖的区间内，并在二聚体控制下将补救引物合并入面板，以便在明确的非靶标风险下恢复此类区域。因此，PCRpanel为超高复孔PCR面板构建提供了一种可扩展、平台无关的解决方案，支持研究和诊断场景中的精确且可重复的靶向测序。

图形摘要