益生菌混合物“Prohep”的安全性评估及其在小鼠肠道微生物调节能力中的纵向研究

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Safety Assessment on Probiotic Mixture “Prohep” and Longitudinal Evaluation on its Gut Microbial Modulation Ability in Mice

　　

中文摘要翻译 益生菌混合物Prohep已被研究作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）和肝细胞癌（HCC）等肝脏疾病的潜在疗法。为评估其安全性，研究人员在CD-1小鼠上进行了一项实验，以评估其急性、亚急性和亚慢性口服毒性。结果显示，摄入Prohep未导致任何发病或死亡，也未在体重、组织病理学、血液学或生化参数方面产生不良变化。因此，Prohep被认为可安全食用，其半数致死剂量（LD50）高于5000 mg/kg（类别5，LD50 > 2000 mg/kg），且未观察到有害作用水平（NOAEL）为2800 mg/kg。此外，研究人员还研究了Prohep在正常饲料和高脂饲料下调节肠道微生物群的能力。基于粪便DNA测序结果，需要连续28天的Prohep补充才能完全重塑肠道微生物群的组成。因此，这28天的补充窗口可能为设计旨在诱导持久、临床意义显著的肠道微生物群调节的人体给药方案提供信息。在停用后28天，仍能观察到Prohep补充对肠道微生物群的调节效应。这些发现为Prohep的药物应用提供了有价值的信息，包括其安全性及益生菌补充的最佳持续时间。

论文解读文章

研究背景与目的

益生菌因其在治疗多种疾病（尤其是胃肠道疾病如代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）和肝细胞癌（HCC））中的潜在治疗优势而备受关注。Prohep作为一种有效的益生菌混合物，通过调节肠道微生物组，已在体内模型中显示出管理MASLD、MASH和HCC的潜力。然而，随着益生菌应用的日益广泛，对其安全性的研究也扩展到不同患者群体，特别是对于多菌株产品，需要进行严格的安全性评估。除了观察到的副作用外，长期定植和持续性以及微生物群组成改变也应纳入新型制剂如Prohep的长期安全性评价。此外，益生菌在初始阶段可能面临现有肠道微生物群的定植抵抗，其定植和调节需要适应时间。因此，了解益生菌在不同时间点如何调节肠道微生物群，对于确定严重临床情况下干预的最佳时机至关重要。本研究旨在通过检测Prohep在小鼠模型中的急性、亚急性和亚慢性毒性来评估其安全性，并进一步研究在正常饲料（NC）和高脂饲料（HFD）条件下，补充和停用Prohep后肠道微生物群的时间变化。

主要技术方法

研究人员采用了多项关键技术方法。首先，依据经济合作与发展组织（OECD）指南，设计了急性口服毒性研究（OECD 423）、亚急性口服毒性研究（OECD 407）和亚慢性口服毒性研究（OECD 408）。动物实验使用了来自香港大学比较医学研究中心（CCMR）的ICR-CD1小鼠（用于安全性评估）和C57BL/6J小鼠（用于纵向研究）。Prohep由研究人员团队开发，包含八种冻干菌株。粪便样本中的脱氧核糖核酸（DNA）提取使用QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒，并进行16S核糖体核糖核酸（rRNA）基因测序（DNBseq平台）。原始序列数据通过QIIME2流程处理，使用DADA2进行降噪以获得精确扩增子序列变异（ASVs），并使用朴素贝叶斯分类器结合Greengenes2数据库进行物种注释。统计分析使用了线性混合模型和Wilcoxon检验。

研究结果

Prohep补充在急性口服毒性研究中未显示毒性

单次口服5000 mg/kg的Prohep未导致任何急性毒性，未观察到发病或死亡，体重、体温、血液学和器官重量均无显著差异。

Prohep补充在亚急性口服毒性研究中未显示毒性

28天重复口服Prohep（500、1400、2800 mg/kg）未引起发病或死亡。尽管在高剂量组雄性小鼠中观察到粒细胞（GR）计数显著增加，以及在雌性中剂量组观察到钠离子（Na⁺）和钾离子（K⁺）水平升高，但这些变化不被认为是测试物相关的毒性，因为它们不具有剂量依赖性或在另一性别中未见。

Prohep补充在亚慢性口服毒性研究中未显示毒性

90天重复口服Prohep同样未导致发病或死亡。观察到一些非剂量依赖性的血液学和生化指标波动，例如雄性中剂量组白细胞（WBC）增加、雌性中剂量组血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）降低。肌酐（CRE）水平在中、高剂量组的雄性和雌性小鼠中均显著升高，但研究人员认为这可能反映了肌肉质量的改善而非肾损伤。钠离子和钾离子水平的变化也更接近正常范围。因此，Prohep的未观察到有害作用水平（NOAEL）确定为2800 mg/kg。

Prohep在不同饮食下对肠道微生物群的调节作用

纵向研究发现，无论喂食NC还是HFD，每天补充Prohep约需4周（28天）才能使肠道微生物群发生稳定改变。在HFD条件下，Prohep补充28天后显著增加了α多样性（香农指数和均匀度），并显著改变了β多样性。在NC条件下，补充14天后α多样性暂时下降，但28天后恢复。停用后28天，NC条件下的Prohep组α多样性反而显著高于对照组。在物种水平，HFD条件下，Prohep补充在14天和28天均富集了多种有益菌，如阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）、双歧杆菌（Bifidobacterium animalis、Bifidobacterium breve）等。特别地，三种菌——Enterocloster属未定种、Anaerotruncus colihominis 和 Akkermansia muciniphila ——在停用后28天仍持续富集。在NC条件下，Bifidobacterium animalis 在补充期间富集，而微球菌科（Micrococcaceae）的一个未分类类群在补充期和停药后均持续富集。

讨论与结论

本研究的讨论部分指出，Prohep的安全性得到了确认，其半数致死剂量（LD₅₀）高于5000 mg/kg，属于类别5，NOAEL为2800 mg/kg。总结而言，摄入Prohep无不良反应或短期/慢性健康相关毒性。关于其对肠道微生物群的调节作用，需要28天的Prohep补充才能完全调节肠道微生物群，且在停用后仍观察到持续的效应。这种持久效应可能与生态位占据和宿主代谢反馈的协同作用有关，特别是像Akkermansia muciniphila这样的菌种，其已知的改善宿主代谢综合征的作用为其持续存在创造了正反馈。研究结论部分翻译如下：“急性、亚急性和亚慢性口服毒性研究对于评估药理物质的安全性和转化研究至关重要。Prohep在这些研究中未表现出毒性。Prohep的LD₅₀被确定为高于5000 mg/kg（类别5，LD₅₀ > 2000 mg/kg），NOAEL为2800 mg/kg。总之，摄入Prohep无不良反应或短期/慢性健康相关毒性。虽然Prohep在正常饲料和高脂饲料喂养条件下对肠道微生物群的调节方式不同，但通常需要28天的补充才能有效调节肠道微生物群。此外，Prohep的持续效应在停用后28天仍可观察到。”该论文发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》期刊。