母体Kisspeptin-10治疗部分挽救母体甲状腺功能减退所破坏的胎儿及出生后心脏编程

《Cardiovascular Toxicology》：Maternal Kisspeptin-10 Treatment Partially Rescues Fetal and Postnatal Cardiac Programming Disrupted by Maternal Hypothyroidism

　　

心血管疾病是全球死亡的主要原因，并与胎儿编程的改变有关。母体甲状腺功能减退（maternal hypothyroidism, MH）损害胎盘功能并诱导宫内生长受限（intrauterine growth restriction, IUGR），这两者都是心血管疾病的危险因素。Kisspeptin-10（Kp10）已被证明可改善甲状腺功能减退大鼠的胎儿-胎盘发育，但其对宫内心脏发育的影响尚不清楚。研究人员使用丙硫氧嘧啶（propylthiouracil, PTU）在Wistar大鼠中诱导MH，并在妊娠第8天开始给予Kp10。在胎儿第18天以及出生后第3天和第21天分析子代心脏。MH降低了胎儿和出生后的体重和心脏重量，损害了心肌细胞增殖，并失调了凋亡和血管生成标志物。母体Kp10给药增强了出生后体重增加，恢复了心肌细胞增殖和核密度，并正向调节了凋亡（Bax/Bcl2）和血管生成（Vegf、Ang2、Flk1）通路。然而，它增加了胎儿心脏中的氧化还原（8-OHdG）和内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激（Grp78、Chop）介质，同时降低了出生后两性别的Chop表达。总的来说，这些发现表明母体甲状腺功能减退破坏了心脏发育和出生后心脏编程，而母体Kp10给药部分缓解了这些影响，突出了kisspeptin可能正向调节心脏发育的新机制。

心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）是全球范围内导致死亡的首要原因，其发生与胎儿编程的改变密切相关。Barker的开拓性研究早已证实，不良母体环境可改变宫内环境，导致胎儿编程受损、宫内生长受限（intrauterine growth restriction, IUGR）以及成年期心血管疾病易感性增加。母体甲状腺功能减退（maternal hypothyroidism, MH）是妊娠期主要的内分泌疾病之一，可损害胎盘形态生理学，造成母胎通讯障碍，进而引起胎盘功能不全和IUGR。然而，尽管已知MH与IUGR存在关联，但MH影响胎儿器官发生及出生后结局，尤其是心脏发育和终身心血管疾病编程的分子机制，仍未得到充分探索。Kisspeptin-10（Kp10）是生殖轴的重要调节因子，近年研究发现其也表达于心脏，但Kp10在心脏发育中的作用尚不明确。已有研究显示，IUGR孕妇血浆中kisspeptin水平降低，提示该肽可能参与正常胎儿发育。研究人员前期工作发现，MH大鼠胎盘中的kisspeptin信号减少，而妊娠期给予kisspeptin可改善胎盘形态与功能，对胎儿发育产生积极影响。因此，研究人员假设，MH中胎盘kisspeptin水平的降低与胎儿心脏发育改变有关，并涉及产前及产后的氧化还原和血管生成状态变化；而妊娠期给予Kp10可能减轻这些效应。该研究旨在评估妊娠期Kp10处理对甲减大鼠胎儿心脏及子代心脏形态、增殖以及凋亡、氧化还原和血管生成介质表达的影响。这是首个表征MH对胎儿和子代心脏增殖、凋亡及血管生成状态的负性影响并展示kisspeptin在甲状腺并发症条件下对胎儿编程的心血管保护作用的研究。该论文发表在《Cardiovascular Toxicology》。

为了开展这项研究，研究人员使用了48只成年Wistar大鼠（来自巴西圣克鲁斯州立大学动物饲养、维持与实验实验室，LaBIO）。通过口服丙硫氧嘧啶（propylthiouracil, PTU）诱导母体甲减，并在妊娠第8天开始每日腹腔注射Kisspeptin-10（Kp10）。实验分为对照组、甲减组和甲减+Kp10组。主要技术方法包括：ELISA定量血浆游离T4水平；免疫组化检测心肌细胞增殖标志物CDC47、凋亡相关因子、氧化应激标志物8-OHdG、抗氧化酶Sod1/Catalase/Gpx1、内质网应激标志物Chop以及血管生成因子Vegf/Flk1/Ang2的蛋白表达；RT-qPCR检测相关基因转录水平。样本采集于胎儿第18天（GD18）、出生后第3天（PND3）和出生后第21天（PND21）。

结果部分，研究人员获得了如下发现。

**母体Kp10给药增加甲减大鼠子代的体重增长**：通过ELISA确认PTU处理组母体及PND3子代血浆游离T4水平显著降低，而Kp10给药虽未在统计学上改变游离T4浓度，但Kp10组PND3子代游离T4与对照组无显著差异。甲减组GD18胎儿身长和体重均低于对照组，Kp10未能逆转这一宫内生长受限。但在出生后，甲减组子代在PND3和PND9体重较低，而母体Kp10给药使PND9体重恢复至对照水平；在雌性中，Kp10组PND15和PND21体重高于甲减组，提示Kp10对出生后生长具有促进作用。

**Kp10给药恢复由母体甲减引起的胎儿心肌细胞增殖活性降低**：甲减组胎儿心脏重量、心肌细胞核密度和CDC47阳性细胞数均低于对照组，表明MH损害心肌细胞增殖。母体Kp10给药虽未恢复心脏重量，但将核密度和增殖活性恢复至对照水平。在凋亡相关因子方面，MH显著增加促凋亡因子Bax表达，而Kp10降低了Bax/Bcl2比值并增加Bcl2表达。对于心脏发育转录因子Isl1、Fgf8和Foxh1，甲减组部分胎儿可检测到这些表达，而Kp10组未检测到，提示Kp10可能促进了心肌细胞分化进程的时序调节。

**母体甲减和Kp10给药以性别和年龄依赖性方式调节子代心脏氧化还原介质和内质网应激标志物的表达**：免疫组化和RT-qPCR结果显示，Kp10给药增加了胎儿心脏中的氧化DNA损伤标志物8-OHdG，同时降低Sod1蛋白和基因表达，而增加了Gpx1基因表达。此外，Kp10还升高了胎儿心脏内质网应激相关基因Grp78和Chop的表达。出生后，Kp10降低了雄性PND3心脏中MH诱导的Sod1蛋白升高，同时增加雌性PND3和PND21的Sod1 mRNA，并提高两性PND21的Gpx1 mRNA。在Chop方面，Kp10降低了PND3雄性和雌性心脏的Chop表达。这些结果表明，Kp10对心脏氧化还原状态的调节呈性别和年龄依赖模式。

**母体Kp10给药刺激胎儿心脏血管生成信号，并以性别和年龄依赖性方式恢复被母体甲减改变的胎儿和出生后心脏Ang2表达**：在胎儿期，MH增加了Vegf蛋白表达并趋向于升高Ang2，而Kp10恢复了Ang2水平并减弱了Vegf免疫染色。同时，Kp10显著增加了Vegf、Flk1和Ang2的mRNA表达。出生后，MH在PND3雌性和PND21两性中均降低了Ang2蛋白表达，而Kp10在不同时间点恢复了Ang2表达。这些结果提示Kp10通过正向调节Ang2等血管生成因子，改善MH引起的胎儿及出生后心脏血管发育异常。

**甲减和母体Kp10给药未改变子代心脏Kiss1表达**：所有检测的心脏样本均未发现Kiss1r基因扩增和蛋白表达；Kiss1免疫染色仅见于出生后心脏的血管内皮，且各组之间Kiss1转录水平无显著差异。这表明Kp10的作用可能并非通过直接激活心脏Kiss1r介导，而是可能经由胎盘-心脏轴间接实现。

在讨论部分，研究人员指出，MH破坏了胎儿心脏发育编程，表现为心脏质量下降、心肌细胞形态和增殖受损，以及血管生成因子失调，这些效应具有性别和年龄依赖性。母体Kp10给药部分逆转了上述改变，恢复了胎儿心脏增殖及出生前后Ang2表达，并调节了凋亡、氧化还原和ER应激相关介质。尽管Kp10未能恢复胎儿心脏质量，但其对细胞增殖和Ang2的调节提示了新的心脏保护机制。由于心脏组织中未检测到Kiss1r表达，研究人员推测kisspeptin的效应可能通过改善胎盘功能和母胎界面信号间接作用于心脏，强调了孕期母体健康对子代心脏代谢疾病编程的重要影响。

研究结论为：母体甲减通过减少心脏质量、损害心肌细胞形态和增殖以及失调胎儿和出生后心脏中的血管生成因子，以性别和年龄依赖性方式损害胎儿心脏发育。相反，妊娠期母体Kp10给药减弱了这些改变，恢复了胎儿心脏增殖和出生前、后心脏Ang2表达，从而提示kisspeptin调节宫内心脏编程的新保护机制。