《Journal of Molecular Evolution》：Genomic and Structural Analysis of Gamete Recognition Proteins in a Broadcast Spawning Echinoderm Mesocentrotus franciscanus
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配子识别蛋白表达于精子和卵子表面，介导配子间的相互作用。目前，配子识别蛋白的遗传基础、结构及其相互作用尚未完全阐明。研究人员利用海胆Mesocentrotus franciscanus新一代高质量从头基因组组装，研究了多种配子识别蛋白的基因组结构、表达及蛋白形
配子识别蛋白表达于精子和卵子表面，介导配子间的相互作用。目前，配子识别蛋白的遗传基础、结构及其相互作用尚未完全阐明。研究人员利用海胆Mesocentrotus franciscanus新一代高质量从头基因组组装，研究了多种配子识别蛋白的基因组结构、表达及蛋白形式，包括精子结合蛋白bindin、卵子精子受体（HSP110）、卵子结合蛋白受体（EBR1），以及卵胶受体（REJ）及其旁系同源物。为促进未来群体遗传学与进化研究，研究人员解析了大型EBR1蛋白的基因组结构，发现其串联CUB-TSP1重复单元数量较该蛋白最初鉴定结果更少。与卵子精子受体的预期相符，EBR1在雌性生殖组织（卵子和雌性性腺）中较其他组织高表达。相反，HSP110在雄性和雌性生殖组织、非生殖组织及发育阶段中的表达水平相似。HSP110可能是一个多效基因，部分参与影响受精过程。研究人员利用蛋白质结构建模和功能结构域预测，提出了EBR1、bindin和HSP110之间潜在相互作用的相关假说，这有助于深入了解海胆精卵相互作用。解析编码配子识别蛋白的基因组结构，结合功能注释与蛋白质结构建模，有助于更深入地研究配子识别蛋白变异的后果及生殖隔离的进化。
**配子识别蛋白的基因组与结构解析：以自由产卵海胆Mesocentrotus franciscanus为模型**
**研究背景与科学问题**
生物物种的关键特征之一是生殖兼容性，不同物种间通常不能产生可育后代。精卵之间的不兼容是生殖隔离的重要机制，而配子识别蛋白（gamete recognition proteins）在精卵识别中发挥核心作用。海胆作为研究受精机制和生殖隔离进化的经典模型，其大多数种类通过自由产卵（broadcast spawning）方式繁殖，便于开展受精实验和配子操作。尽管已有数十年的研究，海胆配子识别蛋白的遗传基础，尤其是一些大型重复蛋白的基因组结构、表达模式及蛋白质相互作用，仍未完全阐明。
此前在Mesocentrotus franciscanus中，卵子表面存在两种候选精子受体：HSP110和EBR1。早期研究对EBR1的重复结构描述为含20个CUB结构域和27个TSP1结构域，其中M. franciscanus特有区域包含9个串联CUB-TSP1重复。然而，基于已有参考基因组（Polinski等，2024）的比对提示该重复数量可能少于初始表征。此外，REJ蛋白家族在精子顶体反应中的作用已被确认，但M. franciscanus中大部分REJ基因的基因组结构尚未解析。为此，研究人员构建了来自不同地理种群的M. franciscanus高质量从头基因组，结合转录组分析和蛋白质结构预测，系统研究了多个关键配子识别蛋白的基因组结构、表达模式和潜在相互作用，以期为群体遗传和进化研究提供基础。该研究发表于《Journal of Molecular Evolution》。
**主要研究内容与结论**
研究人员利用PacBio HiFi长读长测序技术，对采自加拿大不列颠哥伦比亚省巴克利湾（Barkley Sound）的M. franciscanus个体进行了基因组从头组装和注释，并与已发表的加利福尼亚圣迭戈种群参考基因组（GMGI_Mfr1.0）进行了比较。通过手动注释关键配子识别基因，结合RNA-seq表达分析和AlphaFold3结构预测，研究发现：EBR1基因在M. franciscanus中实际含有17个CUB和24个TSP1结构域，其物种特异区段仅含6个串联CUB-TSP1重复，少于最初描述的9个重复；EBR1在卵子和雌性性腺中高表达，符合卵子精子受体的功能；而HSP110在各组织和发育阶段表达水平相似，提示其可能具有多效性。此外，研究预测了bindin、EBR1和HSP110之间的潜在互作界面，提出了EBR1可能以蛋白酶形式切割bindin、HSP110协助稳定bindin构象等可检验假说。这些结果加深了对海胆配子识别蛋白结构变异和生殖隔离进化的理解。
**关键技术方法**
本研究主要使用了以下关键技术方法：PacBio HiFi长读长测序用于基因组组装；Hifiasm和purge_dups进行基因组组装与单倍型去冗余；RagTag利用染色体水平参考基因组进行支架搭建；RepeatModeler和RepeatMasker进行重复序列注释；funannotate流程结合多来源转录组数据进行基因预测与功能注释；HISAT2和StringTie进行转录组比对和组装；featureCounts进行表达定量；InterProScan和SignalP进行蛋白结构域和信号肽预测；AlphaFold3进行单蛋白及复合物结构预测；MUMmer进行全基因组比对；IQ-TREE构建REJ蛋白系统发育树。样本队列包括来自巴克利湾的一只雄性和一只雌性个体的性腺及配子，以及12只雌性个体的卵子。
**研究结果**
*Sequence Data*：两轮PacBio HiFi测序共产生49.2 Gbp数据（约63.7×覆盖度），基因组杂合度为2.55%，重复序列含量41.9%。
*Genome Assembly*：最终基因组组装总长738.5 Mb，包含21条染色体长度支架，支架N50为34.2 Mb。BUSCO完整度为99.6%，较已有参考基因组略有提升。全基因组比对显示两基因组高度共线，未发现大规模染色体重排。
*Gene Annotation*：经筛选获得23,923个基因模型，BUSCO完整度98.2%。功能注释显示18,877个转录本获得GO条目，2,539个基因模型含信号肽。
*Annotation of Gamete Recognition Genes*：在REJ基因家族中，鉴定到10个与S. purpuratus同源的REJ基因（REJ-REJ10），系统发育分析显示每个REJ蛋白在两种海胆间形成直系同源对，旁系同源支系获得强支持。EBR1经手动校正后注释为71个外显子，编码4066个氨基酸。HSP110含18个外显子，定位在支架16上。BND含5个外显子，编码491个氨基酸，在雄性组织特异表达。
*Resolving the Genomic Structure of EBR1*：通过HiFi读段和12个卵转录组的读段比对，排除重复区组装塌陷的可能性。EBR1的M. franciscanus特异区段最终确定为6个串联CUB-TSP1重复，而非初始报道的9个。该区段内6个TSP1外显子序列完全一致，CUB仅有两种单倍型。
*Comparative Analysis of Protein Structure*：对EBR1的N端ADAMTS结构域和CUB-TSP1重复、HSP110及成熟bindin进行了AlphaFold3结构预测。HSP110结构预测置信度较高（ipTM=0.98），而成熟bindin整体置信度低（pTM=0.24），但其B18结构域呈现高置信度α-螺旋。EBR1的CUB-TSP1重复呈强负电荷表面。
*Structural Predictions of Interactions Between EBR1, HSP110, and BND*：三种蛋白复合物模型（EBR1 N端/bindin、EBR1 CUB1-CUB4/bindin、HSP110/bindin）的界面预测置信度均较低（ipTM介于0.10–0.28），提示相互作用预测存在不确定性。然而结合功能域注释，研究提出EBR1可能在bindin的Glu-Ala位点发挥蛋白酶切割作用，并影响HSP110对B18结构域的稳定化。
**讨论与结论**
讨论部分指出，EBR1重复数目的修正得到三条证据支持：无组装错误信号、缺乏重复间多态性以及读段作图模式。HSP110广泛表达提示其除受精外可能具有多效性。结构预测虽未给出高置信度复合物模型，但结合既有遗传学证据，提出了关于EBR1、bindin和HSP110相互作用的假设。REJ基因家族的系统发育支持基因复制事件发生于物种分化前，且不同REJ成员在表达模式上存在分化。
研究结论部分可概括为：本研究提供了M. franciscanus的高质量从头基因组组装，与已有参考基因组相比，在EBR1这一大型重复基因的解析上实现了改进，并补充了来自不同地理种群的基因组资源。研究人员手动注释了参与精卵识别的多种生殖蛋白，揭示其基因组结构和表达模式的新见解，并对两个卵子精子受体EBR1、HSP110及精子蛋白bindin进行了结构预测。最后，研究提出了关于这些蛋白潜在相互作用的可检验假说，为未来棘皮动物配子识别蛋白的进化、多样性及受精生物化学研究奠定了基础。
