《Horticulture, Environment, and Biotechnology》：Physiological responses of different perennial ryegrass genotypes to ice encasement
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多年生黑麦草（Lolium perenne L.）是一种重要的冷季型草坪草种，然而，其尚未被充分理解的冰封胁迫敏感性限制了其在北方地区的广泛使用。因此，本研究旨在更好地了解与胁迫耐受相关的常见性状是否受到冰封的影响，以及多年生黑麦草（PRG）不同基因型之间是否
多年生黑麦草（Lolium perenne L.）是一种重要的冷季型草坪草种，然而，其尚未被充分理解的冰封胁迫敏感性限制了其在北方地区的广泛使用。因此，本研究旨在更好地了解与胁迫耐受相关的常见性状是否受到冰封的影响，以及多年生黑麦草（PRG）不同基因型之间是否存在冰封耐受性差异。研究人员测定了碳水化合物动态、脯氨酸积累和脂质过氧化水平。在两项试验（2023–2024年和2024–2025年）中，于美国密歇根州东兰辛市开展的控制环境研究中，设置了冰封与非冰封条件，并施加三种冰封持续时间（0、15和20天），每个处理4次重复，据此筛选出两个相对耐受型基因型（P2G38和P2）和两个敏感型基因型（P2G9和P1）。P2G38和P2在经历15或20天冰封胁迫后表现出较低的丙二醛（MDA）积累、保留较多的碳水化合物储备以及较高的脯氨酸水平。这些性状与胁迫后的恢复率呈正相关。与根相比，冠部表现出更大幅度的脯氨酸含量和总非结构性碳水化合物（TNC）下降。此外，具有较高TNC、水溶性碳水化合物、贮藏碳水化合物、脯氨酸水平以及较低MDA水平的植株，其恢复率更高。而且，在非冰封条件下，耐受型与敏感型基因型之间的碳水化合物储备、脯氨酸和MDA水平差异小于冰封条件下。因此，保留较高水平的碳水化合物和脯氨酸，同时维持较低的MDA水平，对于多年生黑麦草的冰封耐受性至关重要。各基因型间表现出的差异可能预示着培育抗冬枯型多年生黑麦草的潜力。
**多年生黑麦草冰封胁迫耐受性的生理机制研究——论文解读**
**1. 研究背景与问题**
多年生黑麦草（Lolium perenne L.）是重要的冷季型草坪草和牧草物种，因其种子萌发快、建植迅速而被广泛用于新建草坪。然而，该物种对冬季冰封胁迫高度敏感，这严重限制了其在北方寒冷地区的应用。已有研究表明，多年生黑麦草在经历仅20天冰封后，分蘖存活率即降至50%，其耐受时间约为同属敏感型的早熟禾（Poa annua）的一半，而耐受型草坪草如匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）可存活超过100天冰封。气候预测显示，未来某些北方地区冰封现象可能加剧。当草坪冠层被不透气冰层包裹时，气体交换受阻，导致缺氧或低氧环境及二氧化碳累积，进而引发氧化胁迫、膜损伤和碳饥饿等问题。目前，关于多年生黑麦草冰封耐受性的生理机制尚不明确，缺乏有效的基因型筛选方法和适宜的冰封持续时间标准。此外，冰融后采集冠部组织耗时费力，探究能否使用叶片组织作为大规模育种筛选中冠部采样的替代方案，是提高筛选效率的关键。因此，本研究旨在阐明碳水化合物动态、脯氨酸积累和脂质过氧化等生理性状在不同多年生黑麦草基因型冰封耐受性差异中的作用，确定最有效的组织取样部位和最佳筛选时长，为抗冬枯育种提供理论依据和高效筛选指标。
**2. 主要技术方法**
研究人员于美国密歇根州东兰辛市的密歇根州立大学控制环境条件下，利用一个二倍体多年生黑麦草双亲作图群体（该群体最初为灰叶斑病抗性育种而创制，包含2个亲本和22个后代株系）开展筛选。试验设置4个基因型（P1、P2、P2G38、P2G9）、2种冰封条件（有冰/无冰）、3个冰封时长（0、15、20天）和4次重复，并重复两次（2023–2024和2024–2025）。冰封处理通过密封盆底、包裹醋酸纤维薄膜、喷水形成约4 cm厚冰层并在-1°C维持冰层来模拟低氧胁迫。测定了叶片、冠部和根部的脂质过氧化（以丙二醛MDA含量表示）、脯氨酸含量、总非结构性碳水化合物（TNC）、水溶性碳水化合物（WSC）、贮藏碳水化合物（SC，含淀粉和果聚糖）等生理指标，并通过Canopeo图像分析监测45天恢复期内的绿色覆盖率。采用方差分析（ANOVA）、Fisher氏最小显著差异检验、相关性分析和主成分分析（PCA）进行统计分析。
**3. 研究结果**
**3.1 群体筛选**
研究人员从152个基因型的双亲群体中随机选取22个后代和2个亲本进行20天冰封胁迫。恢复45天后，P2G9、P2G107和P1G98等基因型绿色覆盖率仅约5%，而P2G38达到60%以上，表明群体内存在充分变异，可据此筛选出相对耐受型（P2G38）和敏感型（P2G9）后代，连同亲本P1和P2开展生理机制解析。
**3.2 选定基因型的恢复评估**
通过评估4个基因型在冰封后45天恢复期的绿色覆盖率动态，发现未经历冰封的植株恢复速度快于冰封植株。15天冰封处理后，P2G9严重受损，45天恢复时绿色覆盖率不足10%，显著低于其他基因型；P2、P2G38和P1恢复率相近但均显著高于P2G9。20天冰封进一步抑制所有基因型的再生，但耐受型与敏感型之间的差异更为明显。总体而言，P2G38和P2表现出较强的冰封耐受性，P2G9高度敏感，P1居中偏敏感。
**3.3 脂质过氧化**
通过测定MDA含量发现，冰封处理使MDA水平约为无冰处理的2倍，且随冰封时长增加而升高。在所有基因型和器官中，P2G9的MDA含量最高。根部MDA水平最低，冠部和叶片约为根部的2–3倍。在无冰条件下，各基因型间MDA无差异；在15天冰封后，叶片中P2的MDA最低，冠部中P2G9显著高于P2和P2G38，根部中P2G9在15或20天冰封后均高于P2G38。这表明敏感基因型在冰封胁迫下遭受更严重的膜脂过氧化损伤。
**3.4 脯氨酸含量**
结果显示，无冰封植株的脯氨酸积累量约为冰封植株的2倍，0天处理植株脯氨酸水平约为20天处理植株的2倍。耐受型基因型P2G38和P2的脯氨酸水平整体高于敏感型P2G9和P1。叶片中，15天冰封后P2的脯氨酸积累显著高于P1和P2G9，20天冰封后P2G38显著高于P2G9。冠部在无冰条件下P2G9和P1低于P2和P2G38，但在冰封条件下各基因型间无显著差异。冠部脯氨酸含量随时间下降的速率快于叶片和根部。根部脯氨酸水平始终最低。这些结果表明，耐受型基因型在长期冰封下能维持更高的脯氨酸水平。
**3.5 总非结构性碳水化合物**
冰封使TNC含量比无冰条件降低约60%，20天处理比0天降低近60%。基因型P2G38的TNC水平在所有基因型中最高，耐受型P2G38和P2整体高于敏感型P2G9和P1。叶片中，0天处理TNC高于15和20天处理，P2G38的碳水化合物储备比P1和P2G9高约90%；15天无冰后P2G38和P2高于P2G9和P1，但在冰封植株中基因型间无显著差异。冠部中，0天时P2G38高于P1和P2G9，20天冰封冠部TNC仅为0天植株的26%。根部TNC约为叶片和冠部的一半，20天冰封后所有基因型均大幅下降且无基因型差异。水溶性碳水化合物（WSC）和总贮藏碳水化合物（SC）也随冰封时长增加而迅速下降，冠部和叶片高于根部。长期冰封导致WSC耗竭，消除了基因型差异。在叶片中，15和20天无冰条件下P2和P2G38的SC比P1和P2G9高1.5–2倍，20天冰封后P2G38的SC高于所有其他基因型。淀粉和果聚糖水平随冰封延长而降低，叶片和冠部高于根部。冠部在15或20天冰封后，P2G38的果聚糖含量显著高于P2G9。
**3.6 相关性分析与主成分分析**
在无冰条件下，恢复率与代谢物水平的关联较弱，但与MDA呈强负相关。在冰封胁迫下，恢复率与TNC、WSC、果聚糖、SC、淀粉等碳水化合物指标呈强正相关，与MDA呈强负相关，与脯氨酸呈正相关。TNC与MDA强负相关，与脯氨酸中等正相关。主成分分析显示，无论有无冰封，P2G38和P2均聚集在碳水化合物丰富的一侧，而P1和P2G9位于相反方向，具有较高MDA和较低碳水化合物储备。冰封条件下，P2G38和P2位于PC1正侧，伴随较高碳水化合物、脯氨酸和恢复率；P2G9和P1位于负侧，与高MDA和低碳水化合物相关。
**4. 讨论与结论**
本研究证实，15天冰封处理足以在控制环境下诱导多年生黑麦草基因型间出现明显的存活、恢复及生理性状差异，是有效的筛选时长；20天虽然也可用于筛选，但可能使敏感基因型遭受过度胁迫而缩小变异范围。冰封造成的膜脂过氧化是敏感基因型受害的重要机制，P2G9在20天冰封后接近死亡，其MDA水平最高。脯氨酸在冰封期间作为渗透调节物质和活性氧清除剂发挥保护作用，但长期冰封导致冠部脯氨酸快速下降，而耐受型基因型能维持更高脯氨酸水平。碳水化合物储备的维持至关重要：耐受型基因型在冰封前冠部TNC储备更高，冰封过程中消耗较慢，能为胁迫后恢复提供充足能量。WSC优先被消耗，随后动员SC（淀粉和果聚糖），果聚糖在耐受型冠部维持较高水平，兼有能量储备和膜保护功能。相关性分析和PCA进一步表明，恢复率取决于碳水化合物可用性、膜完整性和脯氨酸水平之间的平衡。冠部组织在TNC、脯氨酸和MDA上表现出最稳定、最一致的基因型分异，是可靠的冰封耐受性鉴定组织；15天冰封后的叶片分析也能捕捉到多数冠部体现的基因型趋势，可作为高通量初筛的替代组织，但最终的生理机制确认仍推荐使用冠部。本研究受限于所用基因型数量较少，但成功确立了冰封耐受性筛选的方法学基础，明确了有效的组织类型和生理指标，为未来开展更大规模多年生黑麦草抗冬枯育种和基因组学研究提供了重要依据。
