HIV-1中央聚嘌呤序列与宿主SAMHD1 dNTPase在人类原代非分裂单核细胞来源巨噬细胞中HIV-1载体转导过程中的相互作用

《Virus Genes》：The interaction between HIV-1 central polypurine tract and host SAMHD1 dNTPase during HIV-1 vector transduction in human primary nondividing monocyte-derived macrophages

　　

无菌α基序和组氨酸-天冬氨酸结构域包含蛋白1（SAMHD1）是一种dNTPase，可在非分裂细胞（如人类单核细胞来源巨噬细胞（MDMs））中耗竭细胞内dNTP池。这些低dNTP水平抑制MDMs中HIV-1逆转录动力学。相比之下，由人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2）和某些猴免疫缺陷病毒（SIVs）编码的辅助蛋白——病毒蛋白X（Vpx）可诱导SAMHD1降解，从而增加细胞dNTP池，并促进MDMs中更容许的感染。研究人员先前的研究表明，中央聚嘌呤序列（cPPT）有助于HIV-1逆转录的完成，特别是在非分裂人肺成纤维细胞中由于dNTP限制导致逆转录动力学延迟时。然而，在巨噬细胞中，SAMHD1建立低dNTP池并在动力学上限制病毒逆转录，cPPT在HIV-1复制过程中的作用尚未得到验证。为解决这一问题，研究人员在使用两种包含或缺失cPPT序列的不同HIV-1载体系统、存在或不存在Vpx的情况下，对转导MDMs的转导效率和荧光强度进行了时间过程分析。研究数据显示，单独插入cPPT或单独Vpx处理均能适度提高HIV-1载体转导效率，而cPPT与Vpx同时存在则显著增强MDMs中的转导效率和荧光强度。总之，这些发现表明cPPT和Vpx协同作用增强非分裂MDMs中的HIV-1载体转导，支持巨噬细胞中cPPT功能与Vpx介导的SAMHD1降解之间存在相互作用。

**HIV-1中央聚嘌呤序列与宿主SAMHD1 dNTPase在巨噬细胞中的功能协同：一项基于原代单核细胞来源巨噬细胞的研究解读**

**研究背景**
HIV-1在体内可感染多种细胞类型，其中包括分裂/活化的CD4⁺ T细胞和非分裂的髓系细胞如巨噬细胞和小胶质细胞。然而，HIV-1在这两类靶细胞中表现出截然不同的细胞生物学和病毒学特征。一方面，感染活化CD4⁺ T细胞后细胞快速死亡并导致免疫耗竭，而感染髓系细胞后细胞长期存活，从而形成寿命较长的病毒储存库并导致病毒持续存在。另一方面，HIV-1在活化CD4⁺ T细胞中快速复制，但在包括巨噬细胞在内的非分裂髓系细胞中复制动力学显著受抑。研究人员先前报道，这种受抑源于巨噬细胞中极低的细胞内dNTP水平，因为HIV-1逆转录酶（RT）在病毒逆转录过程中消耗细胞dNTP。随后研究人员证明，这些低dNTP水平由宿主dNTPase——无菌α基序和组氨酸-天冬氨酸结构域包含蛋白1（SAMHD1）建立，该蛋白在非分裂细胞中尤其高表达。与此相对，HIV-2和某些猴免疫缺陷病毒（SIV）株系编码的辅助蛋白——病毒蛋白X（Vpx）可通过招募宿主CRL4-DCAF-E3泛素连接酶复合物诱导SAMHD1蛋白酶体降解，导致细胞dNTP水平升高，从而增强HIV-1在非分裂巨噬细胞中的复制动力学。此外，所有逆转录病毒在基因组3'端均含有一个多嘌呤序列，而慢病毒还额外含有一个位于基因组中央的多嘌呤序列，即中央聚嘌呤序列（cPPT）。cPPT可作为第二（正链）DNA合成的额外RNA引物，与3'多嘌呤序列共同发挥作用。研究人员先前的研究发现，cPPT序列有助于HIV-1逆转录的完成，特别是在非分裂人肺成纤维细胞中因dNTP限制而导致逆转录动力学延迟的情况下。然而，在巨噬细胞中SAMHD1限制细胞内dNTP池的情况下，cPPT对HIV-1复制的作用尚未得到验证。因此，本研究旨在确定病毒cPPT序列与Vpx介导的SAMHD1降解之间的关系，并探究这些因素在非分裂人类单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）中HIV-1复制过程中的相互作用。

**研究内容与主要结论**
为回答上述问题，研究人员采用了一种先前已描述的VSV-G假型、基于HIV-1的报告载体。该HIV-1 GFP载体原本缺乏cPPT序列，因此研究人员将人工HIV-1 cPPT序列插入载体RNA序列的中部，位于CMV启动子的5'侧。同时，由于Vpx可诱导SAMHD1降解并提高MDMs中的dNTP水平，研究人员以Vpx为工具，探究cPPT与宿主SAMHD1 dNTPase之间的功能相互作用。通过对转导MDMs进行时间过程分析，研究人员发现，单独插入cPPT或单独Vpx处理均仅适度提高HIV-1载体转导效率，而cPPT与Vpx联合存在时，MDMs中的转导效率和荧光强度均出现显著增强。为验证这一发现，研究人员采用了第二种HIV-1载体系统pLVX-IRES-mCherry，该载体本身含有cPPT序列。研究人员通过将cPPT中的多个嘌呤残基突变为嘧啶以失活cPPT，并重复上述分析。结果显示，完整cPPT与Vpx介导的SAMHD1降解组合时，mCherry阳性细胞数和平均荧光强度均达到最高。这些结果表明，cPPT和Vpx在非分裂MDMs中协同增强HIV-1载体转导，支持cPPT功能与Vpx介导的SAMHD1降解之间存在相互作用。该研究论文发表在《Virus Genes》。

**主要技术方法**
人类原代单核细胞从纽约血液中心获得的buffy coats中分离，来自三位健康供者，等量混合以消除供者间差异，并用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分化7天成为MDMs。采用含或不含cPPT序列的VSV-G假型HIV-1 GFP载体，以及含有cPPT或cPPT失活的pLVX-IRES-mCherry载体。用Vpx+或Vpx?病毒样颗粒（VLPs）处理MDMs 12小时。通过Western blot检测SAMHD1蛋白降解；采用基于HIV-1 RT的单核苷酸掺入引物延伸实验检测细胞内dATP水平；通过荧光显微镜和流式细胞术每日分析GFP或mCherry阳性细胞比例及平均荧光强度（MFI）。所有实验设三次重复，采用单因素方差分析，p<0.05为差异显著。

**研究结果**
（1）Vpx介导的SAMHD1降解升高dATP水平。通过Western blot检测，Vpx+ VLP处理的MDMs中SAMHD1蛋白无法检测到，而Vpx? VLP处理的细胞中SAMHD1可检出，证实Vpx可高效降解SAMHD1。进一步采用基于HIV-1 RT的单核苷酸掺入引物延伸实验检测dATP水平，发现Vpx+ VLP处理的MDMs中dATP水平较Vpx?处理组升高4.3倍，表明SAMHD1降解伴随细胞内dNTP池升高。

（2）cPPT与SAMHD1降解协同增强HIV-1 GFP载体转导效率。荧光显微镜图像显示，单独cPPT插入或单独SAMHD1降解仅轻微增强转导效率，而两者组合显著增加GFP阳性细胞数量。流式细胞术时间过程分析显示，单独cPPT或单独Vpx处理在第4天仅产生适度增加，而cPPT载体与Vpx介导的SAMHD1降解联合时，GFP阳性细胞比例显著升高，与荧光显微数据一致。

（3）cPPT与SAMHD1降解协同增强GFP阳性细胞平均荧光强度。鉴于先前研究在成纤维细胞中发现cPPT主要增强GFP表达水平而非转导效率，研究人员进一步分析了GFP阳性细胞的MFI。结果显示，自转导后第1天起，cPPT插入和SAMHD1降解均独立提高MFI；两者联合时，MFI在整个四天时间过程中显著增强。第4天MFI倍数变化总结显示，单独cPPT处理约为7.4倍，单独Vpx处理约为16倍，两者联合时增强更为显著。在具有高dNTP浓度的人活化/分裂CD4⁺ T细胞中也观察到类似的联合效应，但程度小于MDMs。

（4）第二个载体系统验证协同作用。在pLVX-IRES-mCherry载体中，通过将cPPT序列中多个嘌呤残基突变为嘧啶使cPPT失活后，完整cPPT与Vpx介导的SAMHD1降解组合在第4天产生最高的mCherry阳性细胞数和MFI，进一步支持cPPT与dNTP水平升高在非分裂MDMs转导中的正向功能相互作用。

**讨论与结论**
讨论部分指出，cPPT序列具有多种病毒学功能。cPPT在正链DNA合成完成后可形成DNA瓣结构，该结构被认为能促进病毒预整合复合物的核输入，尤其在非分裂细胞中，但这一功能曾被质疑。本研究数据支持cPPT序列与Vpx协同增强非分裂巨噬细胞中HIV-1载体转导的模型，与之前在非分裂肺成纤维细胞中的观察一致。值得注意的是，在MDMs中，Vpx的作用（增加dNTP池）大于cPPT的作用（分别为16倍和7.4倍），而在非分裂肺成纤维细胞中，cPPT效应大于添加dNs（增加dNTP池）的效应。这暗示Vpx在MDMs中的HIV-1转导中可能具有除提高dNTP池之外的额外作用。Vpx和cPPT在HIV-1生命周期中各自发挥多重作用：Vpx在病毒生命周期早期通过增加细胞内dNTP可用性，为高效病毒DNA合成和子代病毒粒子产生提供底物；cPPT则更直接地在逆转录过程中作为正链DNA合成的额外RNA引物。尽管功能不同，两者均被认为与整合前核输入有关。Vpx可通过非经典途径促进核输入，而cPPT介导的核输入机制尚不完全清楚。因此，本研究中Vpx与cPPT联合处理的协同效应可能与其共同促进核输入的作用有关。未来研究应进一步探讨核输入对cPPT与Vpx相互作用的特定贡献。

结论：总之，这些发现表明c