茶树中cBSA介导的miRNA递送系统的建立及Cs-miR163/CsSK1模块在冷胁迫响应中的功能验证

《Plant Physiology and Biochemistry》：Establishment of a cBSA-mediated miRNA delivery system in Camellia sinensis and functional validation of the Cs-miR163/ CsSK1 module in cold stress response

　　

冷胁迫严重制约茶树（Camellia sinensis）的产量和品质。微小RNA（microRNA，miRNA）是植物冷胁迫响应的关键转录后调控因子；然而，由于缺乏高效的遗传转化和核酸递送系统，茶树中的体内功能验证一直受到阻碍。本研究在茶树中建立了一种阳离子化牛血清白蛋白（cationized bovine serum albumin，cBSA）介导的miRNA递送系统。以冷响应miRNA Cs-miR163及其靶基因CsSK1（一种冷耐受负调控因子）作为模型。通过5′ RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（5′ RLM-RACE）和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）瞬时表达实验证实了Cs-miR163对CsSK1 mRNA的直接切割，并在拟南芥过表达株系中证明了其增强的冷耐受性。优化了cBSA制备方案，获得了稳定的cBSA/miRNA复合物，在15–35 °C温度和pH 4.5–7.2范围内具有高保护能力。系统评估了递送参数；确定最佳条件为2 mg/mL cBSA与10 nM miRNA混合，经3 cm枝条溶液吸收处理5天，miRNA递送效率提高约48倍。透射电子显微镜提供了直接超微结构证据，表明cBSA/miRNA纳米复合物通过涉及静电膜吸附、膜内陷和胞质释放的吸附介导内吞作用被内化进入茶树细胞。在优化条件下，cBSA介导的Cs-miR163递送使CsSK1表达沉默约72%，降低了相对电解质渗漏和活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，并显著增强了冷耐受性。该研究阐明了Cs-miR163/CsSK1模块的调控作用，所建立的系统为木本植物功能基因组学研究提供了一种有前景的策略，有待在更多物种和组织中进一步测试。

茶（Camellia sinensis）是重要的多年生木本经济作物，低温胁迫严重制约其产量和品质。微小RNA（microRNA，miRNA）作为植物冷胁迫响应的关键转录后调控因子，其功能验证在茶树中因缺乏高效的遗传转化和核酸递送系统而长期受阻。该研究发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。研究人员以冷响应miRNA Cs-miR163及其靶基因CsSK1（一种冷耐受负调控因子）为模型，旨在建立阳离子化牛血清白蛋白（cationized bovine serum albumin，cBSA）介导的miRNA递送系统，并验证该模块在冷胁迫中的调控功能。研究首先通过生物信息学预测和分子实验确认了Cs-miR163对CsSK1的直接切割关系，并利用拟南芥异源过表达验证了其冷保护功能；随后优化了cBSA制备和递送参数，通过透射电子显微镜揭示了纳米复合物的细胞摄取机制，最终在茶树离体枝条中实现了高效的基因沉默和抗寒性增强。

为了开展这项研究，研究人员使用的主要关键技术方法包括：采用5′ RLM-RACE和GUS瞬时表达实验验证miRNA对靶基因的直接切割；利用农杆菌花序浸蘸法获得Cs-miR163过表达拟南芥株系，通过程序降温存活率、相对电解质渗漏（relative electrolyte leakage，REL）及DAB/NBT组织化学染色评估冷耐受性；通过碳二亚胺偶联法制备cBSA，利用SDS-PAGE和凝胶阻滞电泳表征其分子量、电荷反转及miRNA装载能力；使用琼脂糖凝胶电泳检测复合物在不同温度、pH和存储时间下的稳定性；通过溶液吸收、叶片渗透和叶面喷雾三种方式比较递送效率，并优化cBSA浓度、miRNA浓度、枝条长度和处理时间；采用透射电子显微镜观察纳米复合物在茶树叶片细胞中的超微结构分布。样本来源为两年生茶树品种‘黔茶1号’（Qiancha No. 1），冷敏感品种‘英红9号’（Yinghong No. 9）用于拓展验证。

研究结果如下：

3.1 Cs-miR163响应冷胁迫并靶向负调控因子CsSK1。通过psRNATarget预测并筛选出CsSK1为Cs-miR163的候选靶基因。qRT-PCR分析显示，Cs-miR163在叶片中的表达显著高于茎，且在4 °C冷处理0–48 h过程中持续上调；而CsSK1的表达趋势与Cs-miR163相反，呈现下调。在烟草叶片中共同浸润35S:Cs-miR163和35S:CsSK1-GUS后，GUS组织化学染色和酶活性检测均显示明显抑制，5′ RLM-RACE进一步证实Cs-miR163在预测位点精确切割CsSK1 mRNA。这表明Cs-miR163通过直接切割机制沉默CsSK1。

3.2 Cs-miR163异源过表达增强拟南芥抗寒性。获得5个独立的Cs-miR163过表达拟南芥株系，其中OE-5株系表达量最高且初步抗寒性最强。程序降温至?10 °C恢复3天后，OE-5株系的存活率显著高于野生型Col-0；在0 °C和?10 °C时，OE-5的相对电解质渗漏显著降低，DAB和NBT染色显示H₂O₂和超氧阴离子积累明显减少。证明Cs-miR163正调控冷耐受性。

3.3 cBSA制备与miRNA装载效率。通过优化乙二胺（EDA）/1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）比例、搅拌时间和反应时间，cBSA转化效率达到约90%。SDS-PAGE确认其分子量约为66.5 kDa。凝胶阻滞实验显示，cBSA/miRNA复合物滞留在上样孔并向负极迁移，而游离miRNA、BSA/miRNA和EDA/miRNA复合物均向正极迁移，表明cBSA实现了有效的电荷反转和miRNA浓缩。稳定性测试显示复合物在15–35 °C、pH 4.5–7.2及室温放置72 h条件下均保持结构完整。

3.4 cBSA/miRNA递送参数的系统优化。细胞毒性筛选表明，4和8 mg/mL cBSA导致叶片严重脱水脱落并抑制枝条吸水，而0.5–2 mg/mL仅引起轻微失水，最终选择2 mg/mL作为安全工作浓度。比较喷雾、溶液吸收和渗透三种递送方式，渗透效率最高但会造成机械损伤，故采用无创的溶液吸收。枝条长度从3 cm增至7 cm时miRNA表达逐渐下降，确定3 cm为最佳。递送动力学显示，处理5天时Cs-miR163表达达到峰值。在优化条件下（2 mg/mL cBSA、10 nM miRNA、3 cm枝条、溶液吸收5天），Cs-miR163的递送效率较水对照提高约48倍。

3.5 cBSA/miRNA纳米复合物细胞摄取的超微结构证据。透射电子显微镜观察处理72 h的茶树叶片，对照细胞中未发现电子致密颗粒。cBSA/miRNA处理的细胞中，可见直径约100–300 nm的高电子密度球形纳米颗粒分布于质外体和细胞壁附近，并观察到颗粒聚集在细胞壁—质膜界面，呈现静电吸附特征；高倍镜下可见质膜局部内陷包裹颗粒，与吸附介导内吞（adsorptive-mediated endocytosis，AME）的形态学特征一致；同时在靠近液泡的胞内区域也观察到颗粒，表明已发生胞内内化。

3.6 cBSA介导的Cs-miR163递送沉默CsSK1并增强茶树抗寒性。经cBSA/Cs-miR163处理的茶树枝条在4 °C、?4 °C和?10 °C胁迫下，叶片仅出现轻微边缘黄化，芽保持鲜绿，而对照叶片出现黄化、霜害和芽褐变。在24 °C和4 °C下，处理组叶片的相对电解质渗漏均显著低于对照。qRT-PCR结果显示，处理枝条中CsSK1表达较对照下调约72%。此外，在冷敏感品种‘英红9号’上使用50 nM miRNA处理21天，也显著减轻了冻害并延长了存活时间，表明该系统具有品种间适用性。

在讨论部分，研究人员指出Cs-miR163/CsSK1模块通过“解除抑制”机制发挥作用：冷胁迫诱导Cs-miR163上调，进而沉默负调控因子CsSK1，从而解除对冷响应通路的抑制，类似于miR398在氧化胁迫下抑制CSD1/2的模式。该研究首次在茶树中应用cBSA纳米载体，并首次在植物细胞中提供cBSA/miRNA纳米复合物通过吸附介导内吞进入细胞的直接超微结构证据，与已有的LDH、碳纳米管、金纳米簇等递送平台相比，具有短miRNA递送效率高、无创、生物相容性好等优势。同时讨论了系统性递送的空间限制、安全浓度的品种依赖性以及未来通过表面功能化或整株注射扩展应用的可能性。

研究结论为：总之，本研究阐明了Cs-miR163/CsSK1模块在茶树冷胁迫响应中的调控功能，并在茶树中建立了cBSA介导的miRNA递送系统。据研究人员所知，这是cBSA纳米载体在茶树中的首次应用，也是cBSA/miRNA纳米复合物在植物细胞中经吸附介导内吞途径摄取的首个直接超微结构证据。鉴于该系统仅在有限品种和叶片组织中验证，它应被视为一种有前景的木本植物功能基因组学策略，有待在更多物种和组织中进一步测试。