整合多组学揭示种子超低温保存中程序性细胞死亡过程中微丝细胞骨架的调控机制

《Plant Physiology and Biochemistry》：Integrating Multi- Omics to Reveal the Regulatory Mechanisms of Microfilament Cytoskeleton in Programmed Cell Death During Seed Cryopreservation

　　

程序性细胞死亡（PCD）是超低温保存后细胞活力变化的主要原因之一。微丝细胞骨架是冷胁迫反应和PCD信号级联的核心调节因子，但微丝细胞骨架动态与种子超低温保存过程中PCD之间的分子机制尚未阐明。因此，本研究以超低温保存后活力变化不同的两种芍药（Paeonia lactiflora）种子为实验材料，以微丝细胞骨架为切入点，结合生理学、转录组学和蛋白质组学，探讨其在种子超低温保存PCD发生过程中的作用机制。结果表明，应用微丝细胞骨架稳定剂（鬼笔环肽）提高了超低温保存后种子活力，显著抑制了PCD调节蛋白酶、细胞色素C及相关信号分子，并进一步降低了细胞凋亡率。相反，用微丝细胞骨架解聚剂（氯丙嗪B）处理则产生相反效果。在转录组水平上，差异表达基因（DEGs）主要富集在MAPK信号通路-植物、磷脂酰肌醇信号系统和内质网蛋白质加工。此外，对DEGs进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出以HSP90A、TUBA、cynT、thrC和SNW1为中心的salmon模块，以及以aroDE、NEIL3、thrC、SNW1和PCF11为中心的turquoise模块。在蛋白质水平上，两个比较组中的差异表达蛋白（DEPs）主要富集于内质网蛋白质加工、糖酵解/糖异生和谷胱甘肽代谢等通路。转录组和蛋白质组联合分析显示，DEGs和DEPs均高度富集于内质网蛋白质加工和甘油酯代谢通路。然而，HSP和ALDH家族成员在这两条通路中分别表现出显著的差异表达，在转录和蛋白质水平上均如此。这表明微丝细胞骨架参与了PCD的发生，进而影响超低温保存后的种子活力。其中，内质网蛋白质加工和甘油酯代谢是微丝细胞骨架在种子超低温保存过程中参与PCD的关键通路，HSP和ALDH可能是该过程的核心作用靶点。

植物种质资源是遗传信息的核心载体，对全球生物多样性保护、农业生产和可持续发展至关重要。芍药具有观赏、药用、食用及工业等多重经济价值，其种质资源的长期、高效、稳定且低能耗保存意义重大。超低温保存是植物种质资源长期稳定保存的主要生物技术手段，但某些材料在超低温保存后细胞活力显著下降，这主要与超低温保存诱导的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）密切相关。已有研究表明，微丝细胞骨架对低温高度敏感，并作为信号枢纽参与PCD的启动、信号放大和核心执行因子调控，但微丝细胞骨架动态变化调控种子超低温保存中PCD的分子机制仍不清楚。因此，本研究首次以微丝细胞骨架为切入点，利用外源微丝细胞骨架调节剂处理超低温保存后的芍药种子，整合活力、生理、转录组和蛋白质组分析，旨在阐明微丝细胞骨架在PCD发生中的作用及其调控网络。

研究人员选用采自山西省临汾市曲沃县芍药栽培基地的芍药种子，依据含水量分为高水分组（28.0%，超低温保存后活力下降）和低水分组（4.2%，超低温保存后活力上升），采用直接液氮冷冻法进行超低温保存。随后，分别用微丝细胞骨架稳定剂鬼笔环肽（Phalloidin）处理高水分种子，用微丝细胞骨架解聚剂氯丙嗪B（Chlorpromazine B）处理低水分种子，并测定种子活力、PCD相关生理指标（活性氧ROS、过氧化氢H₂O₂、一氧化氮NO、Ca²⁺、线粒体膜电位、caspase-3/9类似蛋白酶活性、细胞色素C、凋亡率等）。同时开展转录组测序（Illumina NovaSeq平台）和基于DIA质谱的蛋白质组学分析，并借助qRT-PCR验证关键基因表达。研究还利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）和转录-蛋白质组联合分析解析核心调控模块与通路。

3.1 微丝细胞骨架对超低温保存后种子活力的影响：通过不同浓度稳定剂和解聚剂处理，发现鬼笔环肽显著提高超低温保存后种子活力，最适浓度为5 μg/mL；氯丙嗪B显著降低种子活力，且在15 μg/mL时抑制最强，由此确定后续实验浓度。

3.2 微丝细胞骨架对超低温保存后种子PCD相关指标的影响：检测生理指标发现，鬼笔环肽处理显著抑制ROS、H₂O₂、NO、Ca²⁺积累，降低线粒体膜电位、caspase-3/9类似蛋白酶活性和细胞色素C含量，并减少细胞凋亡率；氯丙嗪B处理则相反，激活PCD信号并提高凋亡率。这表明微丝细胞骨架动态变化直接调控超低温保存后PCD的发生程度。

3.3 转录组分析：转录组测序质量高（Q30>99%）。鬼笔环肽组鉴定出2098个DEGs（上调864个、下调1234个），氯丙嗪B组鉴定出646个DEGs（上调147个、下调499个），两组共有342个DEGs。GO富集显示DEGs涉及水分剥夺响应、冷响应、线粒体等；KEGG富集显示DEGs主要富集于MAPK信号通路-植物、磷脂酰肌醇信号系统、内质网蛋白质加工等。WGCNA鉴定出与种子活力和PCD指标动态变化高度相关的salmon模块（核心基因为HSP90A、TUBA、cynT、thrC、SNW1）和turquoise模块（核心基因为aroDE、NEIL3、thrC、SNW1、PCF11），提示thrC和SNW1可能为核心调控因子。

3.4 蛋白质组分析：鬼笔环肽组筛出125个DEPs（上调112个、下调13个），氯丙嗪B组筛出82个DEPs（上调55个、下调27个），两组共有10个DEPs。GO富集显示DEPs涉及氧化应激响应、内质网胁迫响应等；KEGG富集显示DEPs主要富集于内质网蛋白质加工、糖酵解/糖异生、谷胱甘肽代谢、吞噬体、植物MAPK信号通路等。

3.5 转录组与蛋白质组联合分析：九象限图显示转录与蛋白表达存在部分一致性，但整体呈转录变化大、蛋白缓冲的特征，表明翻译调控和蛋白稳定性维持起重要作用。两组DEGs和DEPs共富集于12条KEGG通路，其中内质网蛋白质加工和甘油酯代谢为关键通路。在内质网蛋白质加工通路中，53个DEGs和14个DEPs（鬼笔环肽组）、67个DEGs和7个DEPs（氯丙嗪B组）被鉴定，核心分子包括HSP20、HSP70、HSP90、DNAJA2、NSFL1C、PDIA1、DAD1、BAG1等，且HSP家族成员在转录和蛋白水平均显著差异表达。在甘油酯代谢通路中，关键DEGs包括MGLL、DGD及两个ALDH异构体，关键DEPs包括ALDH、AKR1B、plsC；ALDH在转录和蛋白水平均差异表达，且ALDH.P2与ALDH.1/ALDH.2正相关、与MGLL负相关。

3.6 qRT-PCR验证：选取与PCD和微丝细胞骨架动态相关的基因进行验证，表达趋势与转录组结果高度一致，证实转录组数据可靠。

讨论部分总结：微丝细胞骨架在超低温保存后种子活力维持和PCD调控中发挥关键作用。稳定微丝细胞骨架可抑制线粒体途径PCD，而解聚则加剧PCD。内质网蛋白质加工通路中，HSP家族（HSP20、HSP70、HSP90、HSP40）通过维持蛋白稳态、调节未折叠蛋白反应，参与微丝细胞骨架介导的PCD调控；DAD1作为一种抗凋亡基因，通过维持内质网N-糖基化抑制PCD；BAG1则未显示与HSP70协同作用。甘油酯代谢通路中，ALDH通过降解脂质过氧化产生的有毒醛类缓解PCD，并与MGLL介导的甘油酯分解形成上下游调控级联。这些通路和分子共同构成了微丝细胞骨架调控种子超低温保存PCD的网络。

结论：本研究系统研究了低温条件下微丝细胞骨架的动态变化，并从生理、转录组和蛋白质组水平揭示了其在种子超低温保存PCD中的调控机制。结果表明，鬼笔环肽通过稳定微丝细胞骨架显著提高种子活力并抑制PCD，而氯丙嗪B则降低活力并加剧PCD。转录组和蛋白质组联合分析确定内质网蛋白质加工和甘油酯代谢为核心通路，HSP和ALDH家族成员是其中的关键调控靶点。该研究丰富了植物微丝细胞骨架调控PCD的理论框架，也为未来优化种子超低温保存技术提供了参考，靶向微丝细胞骨架的冻存保护剂有望通过调节PCD过程减轻超低温保存后的细胞死亡。