《Plant Physiology and Biochemistry》：Beyond stomata: a novel role of EPFL9-2 in regulating root system architecture and hydraulics in grapevine
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摘要
表皮 patterning 因子（Epidermal Patterning Factors，EPFs）是一类在多种生理和发育过程中至关重要的植物小肽。尽管 EPFL9 在作物中正向调控叶片气孔形成，但其在其他器官中的功能仍知之甚少。本研究阐明了 VviE
摘要
表皮 patterning 因子（Epidermal Patterning Factors，EPFs）是一类在多种生理和发育过程中至关重要的植物小肽。尽管 EPFL9 在作物中正向调控叶片气孔形成，但其在其他器官中的功能仍知之甚少。本研究阐明了 VviEPFL9-2 在葡萄根系中的作用。研究人员在正常供水（well-watered，WW）和水分胁迫（water-stressed，WS）条件下，评估了砧木‘Kober 5BB’的 epfl9-2 敲除（knock-out，KO）株系的形态与生理性状，并对 WT 与 KO 接穗和砧木组合的嫁接植株进行了评估。此外，还对根系组织进行了多组学与免疫组织化学分析。KO 根系构型表现出向地性角度（geotropic angle）和总长度的显著减少，同时根直径增加，且 KO 茎中木质部导管数量增多而横截面积减小。即使 KO 砧木嫁接 WT 接穗，该表型仍然保持。在 WW 和 WS 条件下，KO 株系均表现出 improved 水分利用效率（water-use efficiency，WUE）。在分子水平上，编辑株系根系表现出木质素和水杨酸通路的强烈激活，这通过根尖共聚焦分析和植物激素谱得到了证实。研究结果首次证明，VviEPFL9-2 功能缺失可诱导根系解剖结构、形态和生理的深刻变化，这些变化可能对 drought 耐受性具有潜在益处。
**论文解读：VviEPFL9-2调控葡萄根系构型与水分利用效率的功能解析**
**一、研究背景与科学问题**
全球气候变化背景下，干旱胁迫已成为制约农作物生产力的核心逆境因子之一。培育抗旱作物品种需要深入理解植物水分关系调控的遗传与分子基础。根系作为植物吸收水分的主要器官，其构型特征——包括根长、分枝角度、向地性和根直径——直接决定植物获取土壤水分的能力。然而，由于根系研究在方法学上的难度，长期以来植物水分关系研究多集中于地上部性状。
表皮 patterning 因子（Epidermal Patterning Factors，EPFs）是一类植物特有的小分泌肽，其家族成员在气孔发育（stomagenesis）中的调控功能已被充分表征。近年来研究发现，EPF/EPFL 家族成员在非叶片器官中也具有新颖功能：如水稻中 EPF1 参与根皮层通气组织形成，拟南芥中 EPFL4/EPFL6 通过 ERECTA（ER）受体调控维管组织发育，棉花 GhEPF2-2 和 GhEPFL9-6 的异源表达可改变拟南芥主根长度与密度。EPFs 由 ERECTA 家族受体激酶感知，共受体 TOO MANY MOUTHS（TMM）决定配体识别特异性。YODA（一种 MAPK 激酶）突变体表现出胚根起始缺陷，暗示该信号通路参与根形态建成。
葡萄作为全球最重要的经济果树之一，其栽培区多属地中海气候，夏季温暖干燥，使葡萄成为研究多年生果树干旱适应的模式系统。葡萄中存在两个 EPFL9 旁系同源基因：VviEPFL9-1 和 VviEPFL9-2。研究团队前期已证实 VviEPFL9-2 是诱导气孔形成的主要旁系同源基因，且该基因在根部也有表达，并在水分胁迫基因型中表达下调。然而，VviEPFL9-2 在根系中的生物学功能尚属空白。基于此，研究人员以常用砧木‘Kober 5BB’（Vitis berlandieri × Vitis riparia）为材料，系统探究了 VviEPFL9-2 功能缺失对根系构型、解剖结构和整株水分关系的影响。
**二、主要技术方法**
研究人员利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得两个独立的 epfl9-2 敲除株系（Kob_epfl9-2a 和 Kob_epfl9-2b），并通过 Illumina 扩增子测序确认突变谱。采用自制的 rhizotron（根箱）系统，在正常供水（WW）和水分胁迫（WS）条件下对根系构型进行无损动态监测。通过嫁接实验将‘Syrah’（Sy）接穗与‘Kober 5BB’（Kob）砧木进行四种组合嫁接，以区分根系突变效应与接穗气孔表型的间接影响。利用转录组测序（RNA-seq）分析编辑株系根系差异表达基因，结合 RRHO 分析比较两个株系转录组一致性。采用 LC-MS 测定植物激素（SA、IAA、DHBA 衍生物）含量，运用 ClearSee 组织透明化结合共聚焦显微镜进行根尖木质素/木栓质组织化学染色，并通过茎横切面显微观察进行木质部导管形态计量与理论水力导度（kh）计算。
**三、主要研究结果**
**1. VviEPFL9-2 敲除影响不同水分条件下地上和地下形态性状**
在两个编辑株系中，成熟叶片气孔密度较野生型分别降低约 78% 和 90%，气孔孔径长度则显著增加。根系表型分析显示，突变株系总根长显著低于野生型，根直径显著增大。根系 spreading angle（RSA）在浅层土壤（Zone A）中，野生型根系呈水平生长优势，而两个突变株系根系角度显著变窄，表现为更陡峭的垂直生长模式。这些根系表型变化独立于水分处理。
**2. VviEPFL9-2 敲除 improves 水分胁迫下的节水行为**
光合气体交换测量显示，在 WW 条件下，突变株系的气孔导度（gs）显著低于野生型；在 WS 条件下，各基因型 gs 趋同。突变株系 Kob_epfl9-2b 在胁迫后 15 天内维持与对照相当的光合速率。两个编辑株系的固有水分利用效率（iWUE = Asat/gs）在两种水分条件下均显著高于野生型。根箱重量监测表明，野生型植株累计失水约 960 g（超过初始含水量的 60%），而编辑株系失水仅 658 g 和 625 g，实现约 33% 的水分节约，从而延迟进入严重基质胁迫阶段。
**3. epfl9-2 突变体根系表型在嫁接野生型接穗后得以维持**
嫁接实验表明，无论接穗为 WT 还是 KO，‘Kober 5BB’ KO 砧木的根系均保持短、粗、陡峭的表型特征，证明 epfl9-2 突变导致的根系构型变化是根系局部作用的结果，而非接穗气孔表型的间接效应。同时，KO 砧木能够降低 WT 接穗的气孔导度，而 WT 砧木可提高 KO 接穗的 gs，表明存在砧木-接穗间的系统性信号传导。
**4. epfl9-2 编辑砧木影响嫁接 WT 接穗的生理与结构参数**
Sy-WT_Kob-WT 组合具有最高的 CO2 同化速率和 gs，Sy-KO_Kob-KO 最低，混合组合居中。iWUE 呈相反趋势。木质部解剖分析显示，Sy-KO_Kob-KO 茎中木质部导管密度最高（129 vessels/mm2），而导管面积最小（8.93 × 10?? mm2）；Sy-WT_Kob-WT 的理论水力导度最高。KO 基因型相关的导管高密度和减小面积有利于避免栓塞和空穴化风险。
**5. EPFL9-2 敲除激活葡萄根系特定代谢通路**
转录组分析显示两个编辑株系共享大量差异表达基因。木质素生物合成通路显著富集，包括编码 PAL、HCT、CCR、CAD 和漆酶（laccase）等酶的多个基因上调表达。水杨酸（SA）代谢通路相关基因（异分支酸合酶、NPR1、DLO、DMR6）也显著上调。此外，NAC 转录因子家族、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和 CASP-like 蛋白编码基因的表达也发生显著变化。激素代谢组学分析显示，编辑株系根系中 SA 分解代谢产物 2,3-DHBA 和 2,5-DHBA 含量显著升高，而生长素（IAA）含量降低。共聚焦显微镜观察显示，编辑株系根尖根冠组织中明显积累木质素/木栓质/角质染色信号，而野生型仅在分化区的原生木质部和凯氏带中检测到染色。
**四、讨论与结论**
本研究表明，VviEPFL9-2 功能缺失触发了一个模拟水分胁迫适应的系统性反应，协调调控地上部和地下部性状。编辑株系根系构型的改变——短根、粗根和陡峭的向地性角度——与已知的 ABA 介导的干旱适应形态学响应一致。木质素通路相关 NAC 转录因子的上调，可能通过 ABA-SnRK2 信号通路驱动，导致木质部新导管形成和根冠屏障建立，以增强对栓塞和渗透胁迫的耐受。SA 积累与生长素水平下降的拮抗关系，为解释根角度改变提供了分子框架。GST 酶的上调则提示活性氧（ROS）清除能力的增强。
嫁接实验证实了砧木中 VviEPFL9-2 敲除可通过砧木-接穗信号传导为整个嫁接植株提供系统性的水分利用效率收益，这对在保持优良接穗品种遗传背景不变的前提下改良葡萄园水分管理具有重要意义。这是首次在葡萄中鉴定到一个单基因靶标，其敲除可同时改善地上部和地下部性状，增强植株对水分亏缺的适应能力，为抗旱砧木育种和遗传改良提供了新的靶点和理论支撑。
