《Frontiers in Aging Neuroscience》：Comprehensive analysis of circRNA-miRNA-mRNA networks to reveal potential cell death, inflammation and oxidative stress-related targets for postoperative cognitive dysfunction
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背景：术后认知功能障碍（POCD）是一种常见的神经系统并发症，涉及对学习和记忆至关重要的大脑区域——海马。环状RNA（circRNA）在调控基因表达中发挥重要作用。研究人员的目的是预测并验证POCD中的circRNA-miRNA-mRNA调控网络。
方法：从基
背景：术后认知功能障碍（POCD）是一种常见的神经系统并发症，涉及对学习和记忆至关重要的大脑区域——海马。环状RNA（circRNA）在调控基因表达中发挥重要作用。研究人员的目的是预测并验证POCD中的circRNA-miRNA-mRNA调控网络。
方法：从基因表达综合数据库（GEO）获取POCD小鼠模型的微阵列数据。采用差异表达分析鉴定差异表达的circRNA、miRNA和mRNA。随后基于从公共数据库获得的miRNA-mRNA配对和miRNA-circRNA配对，通过计算机模拟预测了circRNA-miRNA-mRNA网络。从该全局网络中，基于竞争性内源RNA（ceRNA）假说分析了三个枢纽子网络。在POCD小鼠的海马组织中，通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）定量了关键的circRNA、miRNA和mRNA，并通过蛋白质印迹法（western blot）确认了相应mRNA的蛋白水平变化。在HT22细胞中进行的双荧光素酶实验验证了mmu_circ_0001838（mmu_circRNA_009748）与mmu-miR-337-3p之间，以及mmu-miR-337-3p与PLA2G12B mRNA之间的相互作用。
结果：对公开的POCD相关数据集进行分析，鉴定出12个可能与POCD中程序性细胞死亡、炎症、免疫和氧化应激相关的基因。根据这些结果，研究人员成功预测了一个由4个circRNA、14个miRNA和12个mRNA组成的circRNA-miRNA-mRNA网络。此外，基于ceRNA假说进一步推导出三个circRNA-miRNA-mRNA子网络，包含3个circRNA、4个miRNA和8个mRNA：mmu_circRNA_016232-mmu_miR-6912-5p-四个mRNA（GBP2, BCL3, ADGRL4, PLN）、mmu_circRNA_009748-mmu_miR-362-3p/mmu_miR-337-3p-两个mRNA（RSAD2, PLA2G12B）以及mmu_circRNA_009396-mmu_miR-7030-5p-两个mRNA（SLC25A13, GPR171）。每个预测的circRNA-miRNA-mRNA通路诊断POCD的曲线下面积（AUC）值均超过0.8。RT-qPCR结果证实，与对照组相比，POCD小鼠海马组织中mmu_circRNA_016232、mmu_circRNA_009748、mmu_miR-7030-5p、GBP2 mRNA、BCL3 mRNA、ADGRL4 mRNA、PLN mRNA、RSAD2 mRNA和PLA2G12B mRNA的水平升高，而mmu_circRNA_009396、mmu_miR-6912-5p、mmu_miR-362-3p、mmu_miR-337-3p、SLC25A13 mRNA和GPR171 mRNA的水平降低。蛋白质印迹法证实了相应mRNA在蛋白水平的变化。双荧光素酶实验进一步确认了mmu_circ_0001838与mmu-miR-337-3p以及mmu-miR-337-3p与PLA2G12B mRNA的直接相互作用。
结论：本研究预测并验证了三条关键的circRNA-miRNA-mRNA调控轴，为理解POCD的分子机制提供了新的见解，并为其诊断和干预策略确定了潜在的生物标志物。
论文解读：《Frontiers in Aging Neuroscience》发表的研究：术后认知功能障碍相关circRNA-miRNA-mRNA网络的综合分析
一、研究背景与科学问题
术后认知功能障碍（POCD）是一种常见的手术后神经系统并发症，主要表现为进行性记忆损伤和认知能力下降，尤其在老年人群中发病率高达15%至60%。POCD不仅延长患者住院时间、显著降低生活质量，严重时还会增加死亡率，并且其认知损伤可能持续数年，增加罹患阿尔茨海默病（AD）的风险。然而，POCD复杂的病理生理机制尚不明确，阻碍了全面预防措施的发展。海马体作为负责学习、记忆和情绪调节的关键脑区，在POCD的发生发展中起着核心作用。大量证据表明，海马神经元丢失、萎缩以及神经炎症反应与认知衰退密切相关。因此，深入分析海马体的分子变化对于阐明POCD的发病机制具有重要意义。
已有研究表明，POCD涉及多种病理过程，包括程序性细胞死亡（如凋亡、焦亡、铁死亡等）、中枢神经系统（CNS）的神经炎症以及氧化应激诱导的神经退行性变。针对这些过程的治疗靶点已被广泛探索。环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA，具有高度保守性和稳定性。近年来的研究强调circRNA在POCD病理中的重要作用，它们可通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制充当miRNA海绵，解除miRNA对其靶mRNA的抑制。因此，深入探索circRNA-miRNA-mRNA调控网络对于系统阐明POCD的分子机制和识别新的干预靶点具有重要意义。
二、主要研究方法
研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取了POCD小鼠模型的海马组织转录组数据，包括两个mRNA表达谱（GSE115440和GSE215410，合并后共5个对照和5个POCD样本）、一个miRNA表达谱（GSE95070，5个对照和5个POCD样本）以及两个circRNA表达谱（GSE165798和GSE190880，合并后共6个对照和6个POCD样本）。采用“limma”R包进行差异表达分析，筛选标准为|log2FC| > 0.5且FDR < 0.05。从Genecards数据库获取程序性细胞死亡、炎症、氧化应激和免疫相关基因集。利用miRWalk、miRTarBase、Targetscan8.0、miRDB6.0和ENCORI五个数据库预测miRNA-mRNA调控关系，利用CircFunBase和ENCORI数据库预测miRNA-circRNA调控关系，进而构建circRNA-miRNA-mRNA网络。通过RT-qPCR和蛋白质印迹法（western blot）在POCD小鼠海马组织中验证关键分子的表达变化，并在HT22小鼠海马神经元细胞系中通过双荧光素酶报告基因实验验证直接的分子结合。
三、研究结果
3.1 鉴定POCD与对照样本间的差异表达基因（DEGs）
通过对合并后的mRNA测序数据进行差异表达分析，在POCD组与对照组之间鉴定出39个DEGs，其中15个下调、24个上调。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示这些基因显著富集于cAMP信号通路和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等8条通路。基因本体论（GO）富集分析表明这些基因参与了免疫系统过程等380项生物学过程（BP）。
3.2 筛选与POCD中程序性细胞死亡、炎症、免疫和氧化应激相关的基因
将39个DEGs与Genecards数据库中的八个基因集（凋亡、坏死性凋亡、自噬、焦亡、铁死亡、炎症、氧化应激和免疫基因）取交集，获得23个重叠基因。进一步分析发现其中16个基因在POCD组和对照组间表达水平具有统计学显著差异，包括14个上调基因（如ADGRL4）和2个下调基因（SLC25A13和GPR171）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析揭示了RSAD2、BCL3、ACTA2、PGLYRP1和GBP2蛋白之间的交叉调控关系。
3.3 鉴定POCD与对照样本间的差异表达miRNA（DEmiRNAs）和差异表达circRNA（DEcircRNAs）
miRNA差异表达分析鉴定出14个DEmiRNAs，其中7个上调和7个下调。circRNA差异表达分析鉴定出150个DEcircRNAs，其中73个上调和77个下调。
3.4 预测circRNA-miRNA-mRNA网络
基于ceRNA假说，研究人员成功构建了一个包含30个节点（4个DEcircRNAs、14个DEmiRNAs和12个DEmRNAs）的全局网络。从中提取出三个关键子网络：第一个以mmu_circRNA_016232为中心，连接下调的mmu-miR-6912-5p和四个上调的mRNA（GBP2, BCL3, ADGRL4, PLN）；第二个以mmu_circRNA_009748为中心，连接下调的mmu-miR-362-3p和mmu-miR-337-3p以及两个上调的mRNA（RSAD2, PLA2G12B）；第三个以mmu_circRNA_009396为中心，连接上调的mmu-miR-7030-5p和两个下调的mRNA（SLC25A13, GPR171）。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，所有circRNA-miRNA-mRNA通路的AUC值均超过0.8，表明其具有良好的诊断区分能力。RT-qPCR和western blot验证结果与生物信息学分析一致，证实了上述分子在海马组织中的表达变化。
3.5 CircRNA_009748通过海绵吸附miR-337-3p正向调控PLA2G12B mRNA表达
双荧光素酶报告基因实验证实了mmu_circ_0001838（即mmu_circRNA_009748）与mmu-miR-337-3p之间，以及mmu-miR-337-3p与PLA2G12B mRNA 3‘UTR之间的直接结合。功能实验表明，过表达mmu-circRNA_009748可显著下调mmu-miR-337-3p水平，而敲低mmu-circRNA_009748则上调其水平。mmu-miR-337-3p agomir抑制PLA2G12B mRNA表达，而其antagomir则促进其表达。救援实验进一步证实，敲低mmu-circRNA_009748导致的PLA2G12B mRNA下降可被mmu-miR-337-3p antagomir显著恢复。
3.6 对circRNA-miRNA-mRNA网络中八个基因的富集分析
KEGG富集分析显示这八个基因显著富集于α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢和脂肪消化吸收等五条代谢通路。GO富集分析表明这些基因显著参与刺激应答和免疫应答相关的216项BP、15项细胞组分（CC）和24项分子功能（MF）。
3.7 探索POCD中枢纽基因的上游转录因子（TFs）
通过相关性分析，研究人员鉴定了57个与八个枢纽基因显著相关的TFs。其中BCL3、GBP2、SLC25A13和ADGRL4受超过5个TFs调控，而PLA2G12B、PLN、GPR171和RSAD2受少于5个TFs调控。利用FIMO工具和Cistrome ChIP-seq数据库进一步验证，确认EBF1、IRF1、SOX11、TCF3和STAT3分别作为PLA2G12B、GBP2、ADGRL4、GPR171和BCL3的上游转录因子。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，POCD严重影响患者生活质量，尤其是对手术应激耐受性较低的老年人群。circRNA作为ceRNA网络的核心组分，广泛参与POCD中的神经炎症和细胞凋亡。本研究通过整合生物信息学和实验验证，系统预测并部分验证了POCD相关的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，特别聚焦于mmu_circRNA_009748-mmu_miR-337-3p-PLA2G12B mRNA这一调控轴的功能验证。八个枢纽基因（GBP2、BCL3、ADGRL4、PLN、RSAD2、PLA2G12B、SLC25A13和GPR171）已被证实与神经炎症、凋亡或代谢调控相关，它们共同汇聚于神经炎症、程序性细胞死亡和代谢失调等POCD核心病理通路。
研究结论：本研究成功预测了多个POCD相关的circRNA-miRNA-mRNA网络。主要新颖发现包括：（1）预测了三个与神经炎症或细胞死亡相关的ceRNA子网络；（2）鉴定出三个此前未报道的关键circRNA（mmu_circRNA_016232、mmu_circRNA_009748和mmu_circRNA_009396）；（3）通过RT-qPCR验证了这三个子网络中基因在POCD小鼠海马中的表达变化。网络分析揭示了八个与免疫调节、炎症反应、氧化应激、细胞死亡和代谢相关的核心枢纽基因（GBP2、BCL3、ADGRL4、PLN、RSAD2、PLA2G12B、SLC25A13和GPR171）。尽管如此，本研究提供的是基于生物信息学分析和表达验证的预测性circRNA-miRNA-mRNA互作网络，这些预测轴在海马神经元或体内的功能验证仍有待完成。
