《Frontiers in Immunology》：Identification and experimental validation of prognostic genes associated with dietary restriction-related signatures in bladder cancer
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摘要翻译：背景：膀胱癌（BLCA）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，具有显著的全球负担，然而饮食限制相关基因（DRRGs）在BLCA中的预后相关性仍不清楚。方法：基于公共数据库，通过差异表达分析、单因素Cox回归分析、孟德尔随机化（MR）分析和LASSO回归分析，
摘要翻译：背景：膀胱癌（BLCA）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，具有显著的全球负担，然而饮食限制相关基因（DRRGs）在BLCA中的预后相关性仍不清楚。方法：基于公共数据库，通过差异表达分析、单因素Cox回归分析、孟德尔随机化（MR）分析和LASSO回归分析，鉴定了BLCA中的预后相关DRRGs。构建并评估了一个风险模型，随后利用风险评分和临床特征建立并评估了列线图。基于该风险模型，进一步进行了功能富集、免疫浸润、基因突变和药物敏感性分析。重要的是，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析进行了细胞注释和潜在关键细胞的鉴定。采用qRT-PCR和western blot方法检测目标DRRGs的表达水平。进行细胞转染、体内和体外实验，以分析目标DRRGs对BLCA细胞生物学行为的影响。结果：筛选出三个候选预后DRRGs（RBP7、SREBF1和ZFP64）。该风险模型将BLCA患者分为两个风险组，高风险组患者生存率较差。该模型在训练集和验证集中的AUC值一般在0.60–0.66范围内，提示具有一定的但有限的判别能力。风险评分、年龄、T分期和N分期被确定为独立预后因素，由这些因素构建的列线图显示出中等的预测性能。两个风险组在信号通路、免疫细胞浸润、免疫检查点、突变基因、免疫治疗相关预测指标和药物敏感性方面存在差异。scRNA-seq分析注释了八种细胞类型，其中T细胞显示出候选DRRGs的差异表达，并被确定为与预后DRRG表达相关的潜在关键细胞类型。实验表明，SREBF1和ZFP64在BLCA组织中的mRNA和蛋白水平均过表达。敲低SREBF1或ZFP64可抑制BLCA细胞的多种恶性表型。结论：本研究从先前计算推断的饮食限制相关基因类别中筛选出RBP7、SREBF1和ZFP64作为BLCA的候选预后基因，并建立了一个具有中等预测性能的风险模型，为进一步研究该恶性肿瘤提供了线索。
论文解读：膀胱癌中饮食限制相关预后基因的鉴定与实验验证
膀胱癌（bladder cancer, BLCA）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，具有高复发率和进展率，肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder carcinoma, MIBC）患者预后尤差。尽管化疗、免疫治疗和靶向治疗取得了进展，但客观缓解率低、耐药等问题依然突出，缺乏个体化治疗策略导致疗效不尽人意。饮食限制（dietary restriction, DR）又称热量限制（calorie restriction, CR），已被证实是一种有效的非药物性肿瘤预防干预手段。既往研究基于计算推断构建了包含276个饮食限制相关基因（DRRGs）的基因集，并发现其与肿瘤免疫状态和免疫治疗反应预测指标相关。然而，这些DRRGs在BLCA中的预后意义及其与肿瘤微环境和肿瘤细胞生物学行为的关系尚未明确。为此，研究人员整合公共转录组数据、遗传学分析、预后模型构建、单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析及初步实验验证，筛选并评估了三个候选基因RBP7、SREBF1和ZFP64，旨在为BLCA的预后评估和机制研究提供分子线索。
研究人员采用的主要技术方法包括：基于UCSC Xena数据库获取TCGA-BLCA队列（404例具有完整生存信息的肿瘤样本和18例癌旁正常组织）及GEO数据库的GSE13507（165例BLCA肿瘤样本）和GSE222315（9例肿瘤和4例癌旁对照的单细胞数据）；利用DESeq2进行差异表达分析，与276个DRRGs取交集获得候选基因；通过单因素和多因素Cox回归、孟德尔随机化（MR）分析鉴定预后相关基因；采用LASSO回归构建风险模型并绘制列线图；进行基因集富集分析（GSEA）、免疫浸润分析、体细胞突变分析、药物敏感性预测；对单细胞数据以Seurat流程处理并注释细胞类型；最后通过qRT-PCR、western blot、细胞转染、体外功能实验及裸鼠皮下成瘤和尾静脉转移模型进行实验验证。
研究结果部分：
鉴定119个候选基因。差异表达分析在TCGA-BLCA与对照间共获得8551个DEGs，与276个DRRGs取交集得到119个候选基因。GO和KEGG富集分析显示这些基因参与脂肪酸代谢过程、AMPK信号通路等，蛋白质相互作用网络提示PPARA等处于核心位置。
鉴定三个候选预后DRRGs。基于119个候选基因，单因素Cox回归筛选出26个预后相关基因，多因素Cox回归后获得24个。MR分析显示RBP7、SREBF1和ZFP64为BLCA的危险因素（OR>1），而ULK2为保护因素（OR<1）。由于ULK2的MR方向与单因素Cox结果不一致，最终将RBP7、SREBF1和ZFP64确定为候选预后基因，灵敏度分析支持结果稳健。
构建并验证风险预测模型。基于三个基因的LASSO系数构建风险评分：风险评分 = 0.2183087×表达(RBP7) + 0.2086101×表达(SREBF1) + 0.3088205×表达(ZFP64)。按中位风险评分将TCGA-BLCA患者分为高风险组（HRG）和低风险组（LRG），K-M曲线显示HRG总生存率显著更低。训练集3、5、7年AUC值分别为0.610、0.607、0.620，验证集GSE13507中分别为0.654、0.657、0.627，表明模型具有有限但肯定的判别能力。
构建BLCA患者预后列线图。风险评分、年龄、T分期和N分期被确定为独立预后因素，基于此构建的列线图预测3、5、7年生存的AUC在0.700–0.714之间，校准曲线接近理想线，决策曲线分析显示联合模型净获益优于单独风险模型和N分期模型。
HRG与LRG之间信号通路、免疫细胞和免疫检查点的差异。GSEA显示HRG富集于上皮间质转化（EMT）、MTORC1信号和G2M检查点等通路，而LRG富集于干扰素α反应。免疫浸润分析发现16种免疫细胞存在差异，HRG中调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肥大细胞浸润增加。HRG中17个免疫检查点基因表达显著上调。
HRG与LRG之间突变基因的差异。HRG中TP53（51%）、TTN（48%）、KMT2D（33%）突变频率最高；LRG中TP53（47%）、TTN（46%）、MUC16（28%）居前。RBP7、SREBF1和ZFP64主要以错义突变为主。
HRG与LRG之间免疫治疗相关预测指标和药物敏感性的差异。18个免疫治疗相关预测通路活性存在差异。HRG的基质评分和ESTIMATE评分显著升高，TIDE评分高于LRG但相关较弱。预测有52种药物的IC50在两组间存在显著差异，如长春瑞滨、紫草素等。
T细胞被选为与预后DRRG表达相关的潜在关键细胞类型。scRNA-seq注释出八种细胞类型，T细胞和B细胞在BLCA与对照组间比例差异显著。T细胞中三个预后DRRG均差异表达，因此被确定为潜在关键细胞。CopyKAT分析确认肿瘤样本上皮细胞中存在非整倍体恶性成分。
T细胞与多种细胞类型通讯。CellChat分析显示T细胞与NK细胞、成纤维细胞、上皮细胞、髓系细胞、B细胞和内皮细胞均存在通讯关系。
T细胞随时间分化。Monocle拟时序分析显示T细胞存在9个分化状态和16个亚群，揭示了其发育轨迹。
SREBF1和ZFP64在BLCA中过表达。TCGA及qRT-PCR和western blot实验均证实SREBF1和ZFP64在BLCA组织中的mRNA和蛋白水平显著高于癌旁正常组织。
敲低SREBF1和ZFP64抑制BLCA细胞的恶性表型。在UM-UC3和T24细胞中分别敲低二者后，细胞增殖、迁移、侵袭能力下降，EMT标志物N-cadherin下调、E-cadherin上调。裸鼠皮下移植瘤模型中肿瘤体积和重量减小，尾静脉转移模型中肺转移结节数减少。
讨论部分指出，RBP7属于细胞视黄醇结合蛋白家族，此前已在免疫相关预后特征中被报道；SREBF1是调控脂肪酸代谢的转录因子，在BLCA中通过上调SCD1促进恶性特征；ZFP64为锌指蛋白转录因子，在乳腺癌、肝癌等中发挥作用，但在BLCA中尚未被系统研究。风险模型所划分的两组在通路、免疫浸润、突变及药物敏感性方面的差异，提示HRG可能具有免疫抑制性肿瘤微环境。scRNA-seq揭示T细胞是潜在关键细胞，其与多种细胞类型存在通讯，且具有分化轨迹。SREBF1和ZFP64敲低实验证实了其促癌功能。研究局限性包括DRRGs来源为计算推断、模型判别能力有限、计算推理性分析不能直接代表真实治疗结局、动物实验设计存在不足、混杂因素未充分校正等。研究结论为：本研究筛选出RBP7、SREBF1和ZFP64作为BLCA的预后相关DRRGs，构建了具有中等预测性能的风险模型，可作为BLCA患者风险分层的潜在工具；scRNA-seq提示肿瘤内T细胞是与预后DRRG表达相关的潜在关键细胞类型；SREBF1和ZFP64在BLCA中过表达，敲低可抑制体内外恶性表型，为后续研究提供了线索。
