利用米曲霉（Aspergillus oryzae）脂肪酶制备Macaúba（Acrocomia aculeata）果肉油乙基生物柴油：动力学与工艺参数研究

《Biofuels, Bioproducts and Biorefining》：Macaúba (Acrocomia aculeata) pulp oil ethylic biodiesel using lipase fromAspergillus oryzae: kinetic and process parameters

　　

中文摘要翻译 Macaúba（Acrocomia aculeata）是巴西生物群落的本地物种，已成为植物油生产的可持续替代来源。其果实具有高含油量（3–6吨/公顷），可从果仁和果肉中提取。虽然果仁油适用于食品和化妆品应用，但果肉油已被认为是生物柴油生产的有前景原料，符合巴西国家生物燃料政策。尽管这种生物燃料广泛通过化学路线和甲醇生产，但使用脂肪酶（如由米曲霉（Aspergillus oryzae）生产的商业脂肪酶Eversa Transform 2.0）已被描述为更可持续的替代方案，允许使用粗油等优势。在这种情况下，使用来自甘蔗的乙醇也可以替代甲醇，进一步提高该过程的环境性能。在此背景下，本研究评估了利用米曲霉脂肪酶从Macaúba果肉油生产乙基生物柴油的动力学和最佳工艺参数。动力学研究可同时包含该脂肪酶特征的转酯化和酯化机制。在固定温度（40?°C）下采用中心复合旋转设计（CCRD），以确定最佳操作条件，估计在温和的乙醇与油摩尔比（4.5）附近以及酶（m/moil）和水（m/moil）的上限（分别为2.0%和4.0%），可实现高于95%的转化率。结果表明，与甲醇相比，乙醇具有战略性优势，允许一步添加而不会导致脂肪酶失活。另一方面，最终残余酸度被发现是该脂肪酶作用机制的一个瓶颈，需要进一步的纯化步骤。结果表明，该脂肪酶是利用粗油或轻度预处理油生产乙基生物柴油的有效策略，在实现高转化率的同时，相较于使用碱或酸具有优势。

论文解读

一、研究背景与意义

柴油是巴西车辆 fleet 的主要燃料，约占能源部门总碳排放量的45.4%。为落实《巴黎协定》提出的减排目标，巴西相继出台了“生物柴油法”和“国家生物燃料政策”（Renovabio），强制要求在化石柴油中逐步掺混生物柴油，掺混比例从2008年的2%逐步提升至2025年的15%，并有望继续扩大。这一政策压力正推动油脂工业寻求新的脂质原料来源，Macaúba因此成为备受关注的候选作物。

Macaúba（Acrocomia aculeata）是原产于巴西大西洋森林的棕榈树种，广泛分布于巴西多个地区。其果实的主要部分——果肉（占果实42.6%）和果仁（占果实6.4%）——富含油脂，含油量分别可达55%–69%和55%–58%。果肉油的脂肪酸组成以油酸（C18:1，59.0%）和棕榈酸（C16:0，21.8%）为主，与全球产量最大的棕榈油高度相似。在同等种植面积下，Macaúba可实现每公顷约25吨果实和5吨粗油的产量，产油量可与棕榈油媲美，且适合在退化土地上种植，具有促进当地家庭农业和区域发展的潜力。

传统生物柴油生产主要依赖碱性催化和甲醇路线，虽转化效率可达90%–99%，但存在皂化物生成、废水处理需求大、甘油副产品纯度低等问题。乙醇作为替代醇类，虽然与油的互溶性较低、反应时间较长，但可生产具有更好低温流动性的生物燃料，且巴西盛产甘蔗乙醇，具有非化石来源优势。酶法催化则能克服化学路线的诸多瓶颈。其中，由基因改造米曲霉生产的商业液态脂肪酶Eversa Transform 2.0近年来备受关注，其成本较低、允许使用废弃煎炸油或未精炼原料，并已在多种脂质来源（包括高酸值原料）的生物柴油生产中取得超过96%的转化率。

然而，目前尚无文献报道利用Eversa Transform 2.0脂肪酶和乙醇从Macaúba果肉油生产乙基生物柴油的研究。因此，本研究旨在填补这一空白，评估该酶在此体系中的动力学行为、最佳工艺参数及其可行性。

二、主要技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：利用高效液相色谱-尺寸排阻色谱法（HPLC-SEC）对反应各组分（甘油三酯TAG、甘油二酯DAG、甘油单酯MAG、游离脂肪酸FFA、脂肪酸乙酯FAEE等）进行定性和定量分析；通过气相色谱法（GC-FID）测定脂肪酸组成；基于实验动力学数据，采用MATLAB软件中的Runge–Kutta方法（ode45函数）求解常微分方程组，并利用fmincon函数进行动力学常数拟合；采用中心复合旋转设计（CCRD 23）结合响应面方法（RSM）对乙醇与油摩尔比、酶用量和水用量三个工艺变量进行优化；通过方差分析（ANOVA）评估模型的统计显著性。Macaúba果肉油由Inocas公司（巴西帕图斯迪米纳斯）提供，来自巴西米纳斯吉拉斯州Triangulo Mineiro和Alto Paranaíba地区，经机械压榨获得，未经过预处理。

三、研究结果

3.1 Macaúba油的特征分析

研究人员对收到的Macaúba果肉油进行酸度测定，平均酸值为44.108 ± 0.014 mg KOH/g（以油酸计为22.16% m/m），远高于巴西法规规定的食用油酸度参考值（4 mg KOH/g），属于非食用级油脂。高酸度可能源于采收和榨油过程中果实受损或暴露于高湿高温环境，加速了脂质水解和氧化。由于文献中缺乏该脂肪酶用于Macaúba果肉油乙基生物柴油生产的数据，研究人员对油进行了中和预处理，以评估脂肪酶在低酸介质中的性能。预处理后油酸度降至5.58%（m/m，以油酸计），DAG含量为2.5%（m/m），未检测到MAG，含水量可忽略不计。

脂肪酸组成分析显示，该Macaúba果肉油富含单不饱和脂肪酸（62.40%），主要为油酸（57.86%）和棕榈油酸（4.54%），饱和脂肪酸（19.30%）以棕榈酸（17.88%）为主，多不饱和脂肪酸（17.35%）主要为亚油酸（17.20%）。TAG组成以OOP（20.52%）、OOO（18.29%）、POLi（16.86%）和OOLi（16.32%）为主。由于不饱和与饱和脂质比例较高，该油适合生物柴油生产，所得燃料具有高流动性和低低温结晶倾向。

3.2 Macaúba乙基生物柴油的生产

动力学研究

动力学实验在40°C、900 rpm机械搅拌下进行，采用乙醇与油摩尔比4.5:1、酶用量2.4%（m/m_oil）和水用量3.0%（m/m_oil）的条件。结果显示，在前10小时内，DAG和MAG完全转化，TAG快速消耗至最低水平。DAG和MAG在反应初期（分别约1小时和2小时后）出现短暂浓度升高，随后开始被消耗，最终残余浓度趋近于零。FAEE浓度持续增加，在10小时后达到稳定值。这一特征符合经典的逐步转酯化机制（TAG→DAG→MAG→FAEE）。值得注意的是，初始油酸度仅出现小幅下降，并未完全消耗，最终产物中仍存在残余酸度。

动力学建模分别考虑了不含FFA和含FFA（即同时包含转酯化和酯化机制）两种情形。含FFA的模型对TAG消耗的拟合优度（R2=0.896）优于不含FFA的模型（R2=0.823），表明该脂肪酶确实同时催化转酯化和酯化反应。然而，FFA（R2=0.419）和水的拟合精度较低，这可能与脂肪酶“Ping-Pong-Bi-Bi”作用机制中酶-底物复合物的形成有关，该机制未被经典转酯化方程所涵盖。

工艺参数优化

通过CCRD 23实验设计（17组实验），转化率范围为68.35%至95.80%。最高转化率（95.80%）出现在第12号实验：乙醇与油摩尔比4.5:1、酶用量2.0%（m/m_oil）、水用量2.5%（m/m_oil）。中心点三次重复实验的转化率为87.16%–89.14%，表明实验设计具有良好的可重复性。

方差分析（显著性水平P≤0.10）表明实验设计具有统计显著性（F_calc > F_tab），所得模型R2=0.8173。响应面分析显示，最佳性能区域位于酶用量上限（约2%）和水用量上限（约4%）附近，乙醇与油摩尔比在3.5–5.0之间。通过模型求解，理论上可在特定变量组合（如乙醇与油摩尔比4.50、酶1.80%、水3.98%）实现100%转化，说明最大转化并非单一最优点，而是实验空间内的一个受限区域。

研究还发现，水含量对转化率有显著正效应，这与水-油界面面积和脂肪酶活性位点暴露程度有关。乙醇与油摩尔比略高于化学计量比是必要的，以避免反应逆向进行，但过量的乙醇会降低酶活性。值得注意的是，乙醇可在反应介质中一步添加而不导致脂肪酶失活，这与使用甲醇时需要逐步添加以避免酶变性的做法形成对比。

四、结论与讨论

本研究在实验室规模上探索了利用米曲霉脂肪酶（Eversa Transform 2.0）和乙醇通过酶法路线从Macaúba果肉油生产乙基生物柴油的可行性。在固定温度40°C（酶最适活性温度）条件下，动力学研究表明最大转化在反应10–12小时即可实现。通过CCRD 23实验设计优化，实验观测到的最大转化效率为95.8%（乙醇与油摩尔比4.5:1、酶2%、水2.5%），理论最大转化区域为乙醇与油摩尔比3.79:1、酶1.87%（m/m_oil）、水3.39%（m/m_oil）。

与文献中其他使用Eversa Transform 2.0脂肪酶的研究相比，本研究在较短反应时间内（10–12小时对比20小时和48小时）实现了高转化率，且酶用量相当或更低，体现了时间和成本优势。乙醇相比甲醇更具优势，可一步添加而不引起酶失活。然而，最终产物中仍存在残余酸度，这是该脂肪酶作用机制的一个重要瓶颈，需要额外的精制步骤以满足巴西国家生物柴油政策规定的最终产品酸度上限（0.5 mg KOH/g）。

该研究证实了Macaúba果肉油是通过酶法路线生产生物柴油的有前景原料，使用乙醇（巴西主要来自甘蔗，具有可再生来源）替代甲醇（化石来源），减少了化石原料的使用，降低了残余废物流，可产生更清洁的甘油副产品（几乎无需纯化即可使用），操作条件较文献报道更为温和，同时与巴西国家生物燃料政策相契合，推动了更可持续价值链的发展。该论文发表在《Biofuels, Bioproducts and Biorefining》。