黑腹果蝇S2细胞的代谢足迹：重组狂犬病病毒糖蛋白生产期间的研究发现

《Biotechnology Journal》：Metabolic Footprint of Drosophila S2 Cells: Findings During the Production of a Recombinant Rabies Virus Glycoprotein

　　

过去50年中，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）S2细胞因其能够高产率合成治疗性分子而受到重视。为了进一步提高蛋白质表达水平，必须改善与细胞代谢内在相关的细胞性能。然而，关于S2代谢的信息（包括代谢途径、组分和细胞区室）仍然有限，阻碍了S2细胞性能的改进。本研究利用一株表达重组狂犬病病毒糖蛋白（RVGP）的基因改造S2细胞系，研究了RVGP生产对S2细胞造成的应激。研究人员对野生型和重组型细胞进行了分批培养，并在192 h内定量了27种化合物。RVGP表达激活后，胞外代谢组影响了重组型S2（rec-S2）细胞的生长动力学。尽管RVGP产量很高，但研究人员仍发现了rec-S2细胞生长的底物限制（谷氨酰胺），由RVGP生物合成引起的氨基酸代谢途径变化（亮氨酸、丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸），以及可能影响rec-S2细胞生长的代谢物（乙酸盐、丙酮酸盐、柠檬酸盐和苹果酸盐）。有机酸分析表明，苹果酸盐和乙酸盐的产生与RVGP生产相关。这项工作揭示了S2细胞中的代谢关联，可能对培养基优化和产量最大化产生直接影响，从而提升S2细胞性能以支持放大生产。

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）S2细胞是重组治疗性蛋白生产的重要宿主。尽管其在疫苗候选物表达方面具有优势，但关于S2细胞在重组蛋白生产胁迫下的代谢行为缺乏系统研究。已有研究多针对野生型细胞或孤立的代谢参数，尚未有对比野生型与含诱导型启动子的重组型细胞的代谢足迹（metabolic footprint，指胞外代谢物谱）分析。为此，研究人员以表达重组狂犬病病毒糖蛋白（RVGP）的重组S2细胞（rec-S2）为对象，与野生型S2（wild-S2）进行平行分批培养，在192 h内定量27种胞外代谢物，绘制代谢足迹。该研究发表在《Biotechnology Journal》。研究发现了与RVGP生产相关的代谢关联，为培养基优化和产量最大化提供了依据，有助于S2细胞规模化生产。

关键方法方面，细胞系样本来源为：野生型黑腹果蝇S2细胞购自Invitrogen（DES system），并适应无血清培养基Sf-900 III；重组型S2MtRVGP-H-His由含果蝇诱导型金属硫蛋白（metallothionein，Mt）启动子和潮霉素B筛选标记的质粒转染野生型细胞获得，同时在RVGP的C端引入多组氨酸标签（His-tag）。研究人员采用摇瓶分批培养，于72 h加入CuSO₄诱导RVGP表达；每24 h取样计数，每48 h测定pH；用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量RVGP，用YSI生物分析系统定量葡萄糖和乳酸，用离子选择电极测定氨，用高效液相色谱（HPLC）定量17种氨基酸和6种有机酸；将代谢物浓度按细胞数归一化后转换为Z-score（标准化得分），并进行K均值聚类（K-means clustering，KMC）分析。

3.1 野生型与重组型果蝇S2细胞的生长动力学
通过细胞浓度和活力测定，研究人员发现0–24 h为悬浮适应期；诱导前（0–72 h）两细胞系生长动力学相似；诱导后（72–120 h）rec-S2的比生长速率（μ）明显低于wild-S2，倍增时间较诱导前增加141%，而wild-S2仅增加30%。rec-S2在120–192 h进入减速期和死亡期，细胞浓度从1.15×10⁷降至8.61×10⁶ cells/mL，活力从98.5%降至83.7%；wild-S2在192 h时细胞数几乎翻倍且活力维持在99%左右。结果表明，RVGP诱导表达显著影响rec-S2细胞的生长动力学。

3.2 底物消耗与代谢产物生成
在27种化合物中，葡萄糖、谷氨酰胺和脯氨酸是两种细胞消耗最多的底物。葡萄糖未被耗尽，而rec-S2中谷氨酰胺和脯氨酸在144 h降至较低水平，谷氨酰胺进一步接近限制浓度。主要分泌的代谢物为丙氨酸、氨和乳酸盐。pH在6.28–6.62之间波动，未进行校正。按单位细胞计算比消耗速率后发现，rec-S2在诱导前对谷氨酰胺的消耗速率是wild-S2的3倍，诱导后两细胞系趋于接近，提示谷氨酰胺可能是rec-S2细胞生长的限制性底物。

3.3 与RVGP生物合成相关的氨基酸谱变化
RVGP在72–120 h大量产生，比生产速率达2.17×10^-6 ng·cell^-1·h^-1；144 h后出现降解，144 h时收获量为1.18×10⁶ ng/L，可满足约500只小鼠免疫试验需求。根据RVGP编码序列推算，亮氨酸（10.0%）、丝氨酸（8.3%）、甘氨酸（7.9%）和缬氨酸（7.7%）是含量最高的氨基酸。与wild-S2相比，rec-S2在72–120 h对丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甘氨酸的摄取分别低67%、42%、41%和38%，而诱导前无差异，提示这四种氨基酸的利用被重新导向RVGP合成。

3.4 与RVGP生物合成相关的有机酸谱变化
对乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、丙酸盐和丙酮酸盐的定量显示，柠檬酸盐和丙酮酸盐在两种细胞中趋势相似且水平较低；丙酸盐也基本相似。苹果酸盐在72 h前相似，之后wild-S2产生量更高；乙酸盐在72 h后明显分化，rec-S2产生量更高。因此，苹果酸盐和乙酸盐的产生与RVGP生产相关。乳酸盐产量较低，不足以抑制细胞生长。

3.5 144 h分批培养中野生型与rec-S2的代谢足迹
研究人员将23种氨基酸和有机酸浓度按细胞数归一化并转换为Z-score，构建热图并进行聚类分析。热图显示大多数氨基酸被消耗，丙氨酸因大量产生而模式特殊；谷氨酰胺在rec-S2中消耗较高；柠檬酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐和苹果酸盐也参与代谢差异。聚类分析得到六个簇：大多数氨基酸聚为一簇，丙氨酸与苹果酸盐相似，乳酸盐与丙酸盐相关，柠檬酸盐、丙酮酸盐和乙酸盐各自独立。这些结果鉴别出与RVGP生产相关的差异代谢物。

讨论部分指出，重组蛋白生产会给宿主细胞带来代谢负担，细胞需在生长与异源蛋白合成之间重新分配资源。本研究表明rec-S2在诱导后发生明显的代谢转变。谷氨酰胺缺乏是生长限制因素，因为商业化Sf-900 III培养基中谷氨酰胺浓度低于此前Sf-900 II，而果蝇S2细胞需要外源谷氨酰胺。亮氨酸、丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸的消耗模式提示氨基酸代谢流向RVGP合成。乙酸盐和丙酮酸盐可能在过量葡萄糖条件下经碳溢流途径产生，造成酸性胁迫；柠檬酸盐和苹果酸盐作为三羧酸（TCA）循环中间体，在S2细胞培养中被检出。丙氨酸和氨的大量产生与谷氨酰胺部分氧化有关，但未构成明显抑制；CuSO₄本身未表现出细胞毒性。此外，研究还发现Sf-900 III培养基中存在一种被S2细胞大量消耗但未能精确鉴定的化合物，其特征包括摩尔质量约158 g/mol、含两个羰基且不稳定，可为其他昆虫细胞研究提供参考。

研究结论：本研究提供了分批培养192 h中27种化合物的细胞生长、代谢速率及基于Z-score和聚类工具的代谢组学数据。通过该代谢足迹，研究人员揭示了重组型细胞在重组蛋白生产过程中的整体代谢变化。结果表明，控制RVGP表达的铜诱导启动子激活后，rec-S2细胞生长动力学受到影响。研究人员鉴定出一个底物限制因素（谷氨酰胺）、由RVGP生物合成引起的若干氨基酸途径变化（亮氨酸、丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸），以及可能影响rec-S2细胞生长的若干代谢物（乙酸盐、丙酮酸盐、柠檬酸盐和苹果酸盐）。因此，该工作揭示了S2细胞中的代谢关联，可能对培养基优化和产量最大化产生直接影响，从而提升S2细胞性能以支持规模化生产。