饲料抗菌肽对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）幼鱼生长性能、抗氧化能力、免疫应答及抗病力的影响

《Frontiers in Physiology》：Effects of dietary antimicrobial peptides on growth performance, antioxidant capacity, immune response and disease resistance of juvenile Nile tilapia (Oreochromis niloticus)

　　

摘要：本研究旨在探讨饲料中添加抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）——罗非鱼源内源性piscidin 4（TP4）对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）幼鱼生长性能、抗氧化能力、免疫应答及抗病力的影响。方法：分别配制添加0 g/kg（对照组）、2.0 g/kg、4.0 g/kg和8.0 g/kg TP4的四种饲料，用于初始体重为11.67 ± 0.21 g的罗非鱼。结果：结果表明，投喂含2.0 g/kg TP4饲料的鱼特定生长率显著高于对照组，而饲料转化率低于对照组（P < 0.05）。同时，2.0 g/kg TP4添加显著提高了全鱼粗蛋白含量和肥满度，以及肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性（P < 0.05）。此外，2.0和4.0 g/kg TP4添加增强了抗氧化能力，表现为肝脏过氧化氢酶（catalase, CAT）和过氧化物酶（peroxidase, POD）活性显著升高，丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量显著降低（P < 0.05）。而且，2.0和4.0 g/kg TP4组抗氧化基因sod1、cat、nrf2和atf4的表达水平显著高于对照组（P < 0.05）。另外，2.0 g/kg TP4添加显著降低了谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase, GOT）和谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase, GPT）活性，并提高了碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）活性（P < 0.05）。相关地，2.0 g/kg TP4组促炎基因il8和tnfα表达下调，抗炎基因il10和arg1表达上调，且无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）攻毒后的相对存活率高于对照组，表明2.0 g/kg TP4可改善免疫应答和抗病力。然而，在8.0 g/kg TP4添加水平下，这些对抗氧化能力和免疫的有利影响消失。讨论：综上所述，饲料中添加2-4 g/kg TP4有效增强了抗氧化能力、免疫应答和抗病力，这可能有助于改善生长性能。

论文解读：饲料抗菌肽TP4对尼罗罗非鱼幼鱼生理功能的调控作用

集约化、高密度水产养殖的快速发展加剧了养殖水体的环境胁迫，导致养殖鱼类细菌性疾病频发。长期以来，抗生素是水产养殖中疾病防控的主要手段，但其盲目使用易诱导耐药菌株产生、造成药物残留并破坏水生微生态平衡，严重制约了水产养殖的环境可持续发展。因此，开发安全、高效、无残留且不易诱发细菌耐药性的饲料添加剂已成为水产营养与疾病防控领域的研究热点。抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）是生物先天免疫系统分泌的小分子生物活性多肽，具有广谱抑菌活性、低毒性、零残留和低耐药风险等优点，被视为抗生素的潜在替代品。已有研究表明，饲料中添加外源AMPs可改善哺乳动物、家禽以及多种鱼类的生长性能、抗氧化能力和免疫功能，但大多数研究采用外源AMPs，并依赖低温制粒或后喷涂工艺以避免热降解，而内源AMPs在常规膨化饲料加工条件下的系统评估仍十分有限。

尼罗罗非鱼是我国淡水养殖的优势品种，高温季节常暴发无乳链球菌病，造成严重经济损失。罗非鱼源内源性piscidin 4（TP4）具有良好的生物相容性和中等热稳定性，在短暂高温暴露后仍可维持杀菌活性，适合作为膨化饲料中的功能性添加剂。然而，此前针对罗非鱼AMPs的研究仅验证了体外抑菌活性或检测了部分血清生化指标，尚未同时系统量化全鱼营养沉积、肠道消化酶、肝脏抗氧化酶、抗氧化/免疫基因转录谱及攻毒后存活率，难以形成完整的生理响应链条。此外，已有研究均采用颗粒饲料，与当前普遍应用的膨化水产饲料不一致。因此，研究人员利用TP4的中等热稳定性，将其添加至膨化饲料中，系统考察了TP4对尼罗罗非鱼幼鱼生长性能、抗氧化状态、免疫应答和抗病力的影响。

研究人员从广东海大集团股份有限公司动物与水产研究中心获得罗非鱼源TP4，并制备了四种等氮（33%）等脂（9.5%）的膨化试验饲料，分别添加0（对照组）、2.0（AMP-2）、4.0（AMP-4）和8.0（AMP-8）g/kg的TP4，以微晶纤维素进行等量替换。实验幼鱼购自海南定安百容水产种苗有限公司，初始体重为11.67 ± 0.21 g，随机分为4组，每组6个重复，每桶30尾，在流水养殖系统中进行为期60天的饲养试验。饲养结束后，研究人员测定了生长指标、全鱼体成分、形体指标、肠道消化酶活性、肝脏生化指标、肝脏抗氧化和免疫相关基因表达，并通过腹腔注射无乳链球菌进行攻毒试验，计算相对存活率。主要技术方法包括：饲料采用膨化加工并在55℃干燥11 h；全鱼体成分依据AOAC方法测定；生化指标使用南京建成生物工程研究所试剂盒检测；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测肝脏基因表达，以β-actin为内参；攻毒试验采用1.0×10⁶ CFU/尾的菌量腹腔注射，观察7天死亡率。

研究结果如下：

3.1 生存、生长性能和饲料效率：各组存活率无显著差异。AMP-2组的终末体重、特定生长率和增重率显著高于其他各组，饲料转化率显著降低，采食量也明显减少；AMP-8组的采食量显著高于对照组，但生长指标未表现出持续改善。

3.2 全鱼体成分和形体指标：饲料中添加AMP显著提高了全鱼粗蛋白含量，其中AMP-2组最高；粗灰分含量在三个AMP添加组中均显著低于对照组；粗脂质无显著变化。AMP-2组的肥满度显著高于AMP-8组；AMP-8组的肝体指数显著高于其他组，而各组脏体指数无显著差异。

3.3 肠道消化酶：AMP-2组的胰蛋白酶活性显著高于其他各组，AMP-2和AMP-4组的脂肪酶活性显著升高，α-淀粉酶活性在各组间无显著变化。

3.4 肝脏抗氧化能力：AMP-2和AMP-4组的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性显著升高，丙二醛（MDA）含量显著降低；AMP-2组的POD活性以及AMP-2和AMP-4组的CAT活性均显著高于对照组；总抗氧化能力无显著差异。

3.5 肝脏免疫应答：与对照组相比，三个AMP添加组的谷草转氨酶（GOT）活性显著降低、碱性磷酸酶（AKP）活性显著升高；AMP-2和AMP-4组的谷丙转氨酶（GPT）活性显著低于其他组；溶菌酶活性随AMP水平升高呈现下降趋势。

3.6 肝脏抗氧化相关基因表达：AMP-2和AMP-4组显著上调atf4表达并下调keap1表达；AMP-2组显著上调cat表达，AMP-4组显著上调nrf2和sod1表达；AMP-8组各基因表达与对照组无显著差异。

3.7 肝脏免疫相关基因表达：AMP-2组显著下调促炎基因il8和tnfα表达，并上调抗炎基因il10表达；AMP-4组显著下调myd88表达；AMP-2和AMP-4组均显著上调arg1表达；AMP-8组各基因表达与对照组无显著差异。

3.8 攻毒后相对存活率：与对照组相比，AMP-2和AMP-4组在无乳链球菌攻毒后的相对存活率显著提高。

讨论部分指出，适量TP4添加可提高饲料利用率和生长速率，可能与肠道消化酶活性增强有关。AMP-2组采食量降低可能因其鱼体规格较大，故相对采食量下降。抗氧化方面，TP4通过下调keap1、释放nrf2核转位，进而转录激活sod1和cat等下游抗氧化基因，提高抗氧化酶活性并降低MDA含量；atf4的上调则有助于缓解细胞氧化损伤。免疫方面，TP4通过抑制myd88介导的促炎信号通路，下调il8和tnfα，同时上调il10和arg1，维持肝脏炎症稳态，降低肝损伤酶活性，最终提高攻毒后的存活率。然而，8 g/kg的高剂量未能进一步增强抗氧化和免疫指标，提示AMPs可能存在适宜剂量窗口，过高剂量可能干扰生理稳态。

研究结论可翻译为：综上所述，饲料中添加2–4 g/kg的抗菌肽piscidin 4（TP4）可改善尼罗罗非鱼的饲料利用并提高生长速度；同时，2–4 g/kg TP4通过调控肝脏抗氧化相关基因表达增强抗氧化能力，并通过调节肝脏促炎和抗炎基因表达、平衡炎症信号级联来提高免疫功能和抗病力，从而维持鱼体健康。总体而言，本研究中2–4 g/kg TP4对罗非鱼的生长和健康具有益处，而≥8 g/kg TP4可能产生次优的生理效果。适量TP4可能对促生长和鱼体健康发挥协同作用，其潜在机制有待进一步研究。该研究论文发表在《Frontiers in Physiology》。