转移性三阴性乳腺癌中依赖一氧化氮的代谢和基因失调

《Journal of Biological Chemistry》：Nitric oxide dependent metabolic and genetic dysregulation in metastatic triple-negative breast cancer

　　

慢性炎症驱动多种疾病，包括癌症，其中炎症与转移相关，而转移是90%癌症死亡的原因。肿瘤炎症驱动诱导型一氧化氮合酶（NOS2）和环氧化酶2（COX2）表达，两者均与癌症不良预后相关。在本文中，研究人员在小鼠三阴性乳腺癌同种异体移植肿瘤模型4T1中敲除了NOS2基因，并检测了免疫功能完整的BALB/c小鼠中原发性乳腺肿瘤向肺部的转移扩散。值得注意的是，虽然亲本4T1肿瘤具有高度转移性，但4T1 NOS2^-/-肿瘤的转移几乎被消除。在细胞培养中，研究人员发现NOS2产生的一氧化氮（NO）通过刺激COX2诱导糖酵解表型、表观转录组失调以及前列腺素E2合成。细胞因子添加导致DNA损伤，推测是由NO引起的。人结直肠癌细胞系DLD1得到相似结果。对4T1细胞的RNA测序揭示了NOS2依赖性的与染色体和DNA复制调控相关的mRNA减少，包括细胞周期检查点，以及与RNA去甲基化（包括tRNA去甲基化）相关的mRNA减少。肿瘤微环境的免疫分析显示，原发肿瘤处于免疫抑制状态，细胞毒性T细胞低，表达干扰素γ（IFNγ）的髓源性抑制细胞高，而IFNγ可诱导NOS2表达。综合来看，这些数据表明肿瘤细胞中高水平的NOS2可能通过癌症相关因子的广泛积累驱动转移——包括代谢失调、遗传失调以及炎症性前列腺素的增加——所有这些因素共同促进侵袭性癌症的发生。

**一、研究背景与科学问题**

慢性炎症是推动包括癌症在内的多种疾病进展的重要因素，但其加剧疾病的具体机制尚不清楚。在癌症中，炎症与肿瘤转移密切相关，而转移是90%癌症患者死亡的原因。肿瘤炎症的一个重要后果是诱导型一氧化氮合酶（NOS2）和环氧化酶2（COX2）的表达，这两种酶均与癌症不良预后相关，并已成为癌症治疗的临床试验靶点。既往研究提出了NOS2和COX2促进癌症进展的多重机制，包括基因表达的表观遗传改变、导致侵袭性糖酵解状态的代谢失调、驱动上皮-间质转化（EMT）以及免疫抑制。然而，由于缺乏在免疫功能完整宿主中利用天然内源性NO水平进行研究的合适模型，NO驱动肿瘤转移的底层机制仍不明了。本研究聚焦于三阴性乳腺癌（TNBC）4T1小鼠模型，旨在揭示NOS2驱动肿瘤转移的机制。4T1细胞源自小鼠肿瘤，可在免疫功能完整的小鼠中研究，具有TNBC表型，即丧失雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2这三种典型乳腺癌药物靶点。TNBC具有侵袭性强、易转移且缺乏靶向治疗的特点。研究人员先前已证明，4T1细胞和人结直肠癌细胞DLD1中NOS2诱导和NO产生水平惊人地高，可达到与巨噬细胞相当的水平。

为阐明这一问题，研究人员采用CRISPR/Cas9技术在4T1细胞中敲除NOS2基因，并在免疫功能完整的BALB/c小鼠中检测原发肿瘤生长和肺转移情况。研究发现，虽然原发肿瘤生长不受影响，但NOS2敲除几乎完全消除了肺转移。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。

**二、主要技术方法**

研究人员使用的主要技术方法包括：CRISPR/Cas9基因敲除技术构建4T1 NOS2^-/-细胞系；Western blot检测蛋白表达；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测mRNA水平；活细胞一氧化氮检测（氧合血红蛋白法）；Seahorse XFe96代谢分析仪实时测定糖酵解和氧化磷酸化产生的ATP；质谱法测定α-酮戊二酸水平；竞争性ELISA检测前列腺素E2（PGE2）和m6A水平；mRNA测序（mRNA-seq）及基因集富集分析（GSEA）；流式细胞术进行肿瘤微环境免疫分型和DNA损伤（γH2AX）检测。动物实验中，50,000个细胞注射入BALB/c小鼠第四乳腺脂肪垫，每组8只，约20天后处死，由ACVP认证的兽医病理学家评估肺转移。细胞系来源：4T1细胞获自亚利桑那大学癌症中心实验小鼠共享资源（EMSR）设施，DLD1细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

**三、主要研究结果**

**IFNγ通过JAK/STAT通路驱动肿瘤细胞NOS2表达**

研究显示，在4T1细胞中，干扰素γ（IFNγ）是NOS2表达的最大刺激因素，白细胞介素1β（IL1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）可进一步增强诱导效果。IFNγ和TNFα诱导的NOS2表达在约8小时达到最大，信号转导与转录激活因子1（STAT1）和STAT3均通过磷酸化被激活，其中磷酸化STAT3（pSTAT3）水平先升高（约4小时达峰），pSTAT1水平约8小时达峰。JAK抑制剂鲁索替尼完全消除了NOS2的mRNA和蛋白诱导，表明NOS2表达主要依赖于IFNγ-JAK/STAT信号通路。此外，研究人员检测了PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物）活性，发现内源性NO并未抑制4T1细胞中PTEN活性。

**NOS2^-/- 4T1肿瘤细胞缺乏转移能力**

三种细胞系（野生型WT及两个独立敲除克隆KO1、KO2）形成的原发肿瘤生长速度相似。然而，野生型4T1肿瘤广泛转移至肺部，而NOS2敲除肿瘤几乎无转移。在肿瘤裂解物中检测NOS2表达发现，无论肿瘤细胞NOS2状态如何，肿瘤微环境中其他细胞类型（如免疫细胞、内皮细胞）仍可表达NOS2。

**4T1原发肿瘤处于免疫抑制状态**

流式细胞术免疫分析显示，野生型和NOS2敲除肿瘤均处于免疫抑制状态：髓系细胞和T细胞数量大致相等，但细胞毒性T细胞和活化辅助性T细胞数量低，活化调节性T细胞存在。免疫抑制性髓源性抑制细胞（MDSC）丰富，单核细胞型（Mo-MDSC）和多形核型（PMN-MDSC）数量大致相等。免疫抑制性M2巨噬细胞（精氨酸酶-1⁺）占优势于抗肿瘤M1巨噬细胞（NOS2⁺）。多种免疫细胞表达IFNγ，尤其是MDSC，推测其导致肿瘤中NOS2表达。

**NOS2表达细胞氧化磷酸化受抑制**

Seahorse代谢分析显示，细胞因子诱导NOS2后，野生型4T1细胞糖酵解来源的ATP百分比增加18%，达到总ATP的66%；NOS2抑制剂1400W可使糖酵解百分比恢复至50%以下。NOS2敲除细胞在细胞因子存在下无糖酵解百分比变化。DLD1细胞也呈现类似但更显著的变化（增加27%，达73%）。4T1细胞总ATP在NOS2激活时下降约50%。细胞因子刺激使4T1和DLD1细胞中α-酮戊二酸水平降低最多3倍，但NOS2敲除细胞无此变化。α-酮戊二酸的丢失不仅抑制氧化磷酸化，还移除了表观遗传去甲基化关键底物。

**NOS2刺激环氧化酶2并增加炎症性前列腺素**

PGE2在无细胞因子条件下即高水平表达，提示COX2在癌细胞中组成性表达。细胞因子添加使4T1和DLD1细胞PGE2水平增加约50%，NOS2抑制剂1400W可逆转此增加，说明该增加直接由NO产生所致。值得注意的是，NOS2敲除细胞在细胞因子添加后PGE2出现约6倍增加，机制尚不清楚。

**NOS2表达细胞发生表观遗传改变**

细胞因子暴露后，野生型4T1和DLD1细胞m6A水平增加超过2倍（近3倍），NOS2敲除细胞无增加；NOS2抑制剂1400W可逆转此增加。这表明内源性NOS2产生的生理水平NO导致肿瘤细胞表观遗传失调。

**转录组分析提示一氧化氮依赖性基因组不稳定性**

mRNA-seq及GSEA分析发现，在细胞因子存在条件下比较NOS2 KO1与WT 4T1细胞，鉴定出14个富集基因集和3个基因集簇。其中10个富集通路涉及DNA复制和细胞周期调控，提示WT 4T1细胞可能丧失复制调控并出现基因组不稳定性。另有2个富集通路显示WT 4T1细胞中RNA和tRNA甲基化基因丧失，与m6A水平变化一致。NOS2和COX2 mRNA水平从RNA-seq数据中提取确认：细胞因子处理后NOS2 mRNA大幅增加；COX2 mRNA在4T1和KO1细胞中有或无细胞因子时均高表达。

**细胞因子诱导的DNA损伤通过流式细胞术揭示**

双色流式细胞术同时检测总H2AX和磷酸化H2AX（γH2AX）发现，细胞因子添加导致4T1和DLD1细胞γH2AX显著增加，表明发生DNA损伤，推测由NO产生所致。RNA-seq数据显示4T1细胞在细胞因子添加后H2AX mRNA显著降低，NOS2抑制剂可部分逆转此效应。

**四、讨论与结论**

研究证实NOS2敲除在4T1 TNBC模型中严重抑制转移，但不影响原发肿瘤生长，提示NOS2驱动的改变主要影响肿瘤细胞迁移、免疫逃逸或远处定植能力。肿瘤微环境免疫分析表明，两种肿瘤均处于免疫抑制状态，且免疫抑制并非由肿瘤细胞NOS2导致，可能与肿瘤细胞组成性高表达PGE2有关。NO产生使PGE2增加约50%，可能进一步促进免疫抑制并影响肿瘤细胞进入血液或淋巴系统。结合既往COX2抑制剂和NOS2敲除小鼠研究，抑制COX2同时抑制肿瘤细胞和免疫细胞NOS2的策略可能成为有效的乳腺癌治疗策略。

代谢方面，NO通过抑制细胞色素氧化酶（复合物IV）和三羧酸循环中的顺乌头酸酶，导致氧化磷酸化受抑和糖酵解表型，这是侵袭性肿瘤的又一特征。表观遗传方面，NO抑制2-ODD去甲基化酶家族（Fe(II)/2-OG依赖性双加氧酶），导致m6A增加约2.5倍，改变表观遗传景观。转录组分析提示NOS2与DNA损伤修复和细胞周期进程通路相关，NO存在时这些通路基因下调。细胞因子诱导DNA损伤（γH2AX增加），可能通过NO产生。DNA损伤反应（DDR）细胞周期检查点在癌症中常丢失，允许癌细胞持续增殖并获得基因组不稳定性。研究提示NOS2依赖性遗传失调与转移之间可能存在直接联系。

总之，研究证明TNBC小鼠模型中NOS2敲除导致转移丧失。虽然连接NO产生与肺转移丧失的机制尚未完全解决，但研究发现了多个可能相互关联的NOS2依赖性后果：诱导糖酵解状态、前列腺素依赖性免疫抑制、翻译和遗传失调，这些因素共同促进TNBC的侵袭性进展。