整合膜RAS蛋白酶Rce1的催化特性

《Journal of Biological Chemistry》：Catalytic properties of the integral membrane RAS protease Rce1

　　

整合膜蛋白酶Rce1切割异戊二烯化的CaaX蛋白，包括所有RAS GTP酶，作为其翻译后成熟的一部分。该切割去除-aaX残基，是RAS及其致癌形式正确定位和信号传导特性所必需的。酵母和哺乳动物Rce1的生化稳定性较差，阻碍了活性形式Rce1的纯化，并限制了对其他催化特性的研究。研究人员在此鉴定出黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Rce1具有良好的生化稳定性，纯化后具有催化活性。纯化蛋白重现了Rce1已知特性，包括对异戊二烯化CaaX底物的特异性。与其他整合膜蛋白酶一样，该酶具有约20 hr^-1的低转换数(k_cat)。前稳态动力学分析显示产物释放是限速步骤。研究人员的数据表明，纳摩尔水平的Zn²⁺可抑制Rce1，但金属不参与催化。数据提示Zn²⁺是相对于底物的竞争性抑制剂。信号脂质磷脂酸(PA)也在体外抑制该酶，提示Rce1的细胞活性可能受脂质和/或Zn²⁺调节。这些研究结合结构预测和先前研究，提出活性位点含有催化性Glu-His-His三联体氨基酸，该三联体协调底物并形成抑制性Zn²⁺位点。这项工作增进了对该酶的理解，并为Rce1抑制手段提供了见解。

研究背景：C端含有CaaX序列基序的蛋白质，包括所有RAS GTP酶，经历三步连续的酶促修饰以增强膜亲和力或稳定蛋白质-蛋白质相互作用。第一步由法尼基转移酶(FTase)或香叶基香叶基转移酶-I(GGTase-I)催化半胱氨酸异戊二烯化；第二步由RAS转化酶(Rce1)切割异戊二烯化半胱氨酸与-aaX残基之间的肽键；第三步由异戊二烯半胱氨酸羧基甲基转移酶(ICMT)催化甲基化。Rce1是位于内质网(ER)膜的多跨膜蛋白。由于RAS是癌症中最强的致癌驱动因子之一，CaaX加工酶被视为癌症治疗靶点。FTase抑制剂在临床中效果有限，而Rce1因在体内缺乏补偿性酶活性而更具吸引力。然而，Rce1一直未以活性形式纯化，其催化速率未知，催化机制也存在争议。此前对酵母和人源Rce1的研究受限于其生化稳定性差，无法获得足量活性酶。该研究论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。研究人员筛选多种后生动物同源物，发现黑腹果蝇Rce1(DmRce1)在去污剂溶液中具有良好稳定性和催化活性，并利用纯化蛋白系统表征了其酶学性质。

主要技术方法：研究人员利用荧光检测尺寸排阻色谱(FSEC)筛选真核Rce1同源物；在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的DmRce1，经十四烷基麦芽糖苷(TDM)提取、GFP亲和纯化、蛋白酶切去标签、尺寸排阻色谱(SEC)交换至glyco-diosgenin(GDN)去污剂获得纯化蛋白；采用内淬灭荧光肽模拟K-RAS4B C末端并检测切割活性；用GFP荧光定量微粒体中Rce1含量以计算动力学参数；运用前稳态动力学分析反应限速步骤；用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定金属含量；用Zn-NTA缓冲体系控制游离Zn²⁺浓度；用AlphaFold3和ColabFold进行结构预测。

研究结果：

1. 纯化具有催化活性的Rce1：DmRce1因其表达水平和在去污剂中的单分散洗脱特征被选中。其与人源Rce1约38%氨基酸一致，AlphaFold3预测两者结构整体折叠相同，C_α原子RMSD为0.7 ?。纯化的DmRce1在GDN去污剂中具有强催化活性，而在TDM中活性极低。纯化酶特异性切割含法尼基的CaaX底物，对无法尼基的肽无活性，重现了微粒体来源Rce1的底物特异性。pH活性谱显示pH 5.5至8.5范围内活性较强，最适pH为6.5。

2. Rce1的动力学表征：以荧光定量微粒体中Rce1-GFP含量后，微粒体来源Rce1的稳态动力学符合Michaelis-Menten模型，k_cat为20.0±3.2 hr^-1，表观K_M,app为56±16 μM。纯化的Rce1在GDN中表现为底物抑制型别构sigmoidal动力学，k_cat约6 hr^-1，K_half,app约9 μM，K_i约100 μM。纯化酶对底物的表观亲和力高于微粒体中的酶，研究人员认为这可能与去污剂胶束相对脂质膜具有更小表面积有关。

3. 脂质影响Rce1活性并缓解底物抑制：在GDN胶束中加入不同脂质后，磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)分别将Rce1活性提高约2.5倍和1.6倍，磷脂酰丝氨酸(PS)无显著影响，磷脂酸(PA)则将活性降至约14%。PC和PA的效应均呈剂量依赖。补充25:1摩尔比PC后，高浓度底物对纯化Rce1的抑制作用消失，动力学呈现Hill系数约2的sigmoidal特征，k_cat为19.5±0.3 hr^-1，K_half,app为7.1±0.2 μM，与微粒体中的k_cat接近。PC是ER含量最高的脂质，而PA含量较低且随细胞状态变化，因此Rce1活性可能受脂质调节。

4. 前稳态动力学鉴定产物释放为限速步骤：利用Rce1低转换数的特点，研究人员提高酶浓度并缩短荧光读数间隔，观察到明显的前稳态爆发相。单指数加线性模型拟合得到爆发相表观速率常数k_obs约200 hr^-1，约为稳态k_cat的10倍。爆发幅度表明至少19%至25%的纯化酶具有催化活性。由于荧光信号来自切割后荧光基团与淬灭基团分离，即产物释放过程，因此产物释放是Rce1反应循环中的限速步骤。研究人员推测疏水的异戊二烯化切割产物释放可能比-aaX肽释放更慢。

5. Rce1受Zn²⁺及其他二价阳离子抑制，但不受常见蛋白酶抑制剂抑制：广谱丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制剂混合物不影响Rce1活性。100 μM的Zn²⁺或Cu²⁺完全抑制酶活性，Ca²⁺和Mn²⁺无影响，Ni²⁺、Mg²⁺和Co²⁺有轻微抑制。利用Zn-NTA缓冲系统滴定游离Zn²⁺，测得IC₅₀约为7 nM，处于真核细胞游离Zn²⁺动态调节范围。Zn²⁺抑制可被EDTA完全逆转。动力学分析显示Zn²⁺使K_half,app由7.1±0.2 μM升至15.5±0.4 μM，而k_cat基本不变，表明Zn²⁺是相对于异戊二烯化CaaX底物的竞争性抑制剂。

6. Rce1不是金属蛋白酶：ICP-MS显示纯化Rce1中锌、铜和铁均低于化学计量量。短暂EDTA处理可将这些金属含量进一步降低，但酶活性保持不变，表明Rce1不依赖金属离子催化，不是金属酶。

讨论与结论：研究表明Rce1的催化活性受去污剂胶束性质影响，提示胶束可能影响底物接近或产物释放。脂质PC和PE可激活Rce1，而PA可抑制Rce1，但混合去污剂-脂质胶束中的效应可能来自胶束性质变化，也可能来自特异性脂质-蛋白相互作用，仍需进一步研究。Zn²⁺竞争性抑制的机制可能涉及活性位点中E175、H208和H261形成的Glu-His-His三联体。AlphaFold预测显示这三个残基的侧链在空间上相互靠近，且当预测中加入Zn²⁺时，离子被放置在活性位点三联体处。该排列与整合膜金属蛋白酶ZMPSTE24中HEXXH基序配位Zn²⁺的方式类似，但Rce1中的金属不参与催化，Zn²⁺反而作为抑制剂。ColabFold预测的Rce1与KRAS-4A复合物将RAS的CaaX基序置于活性位点，切割位点位于Glu-His-His三联体附近，与预测的Zn²⁺位点重合，进一步支持竞争性抑制模型。纯化活性Rce1的获得消除了该酶生化研究的主要障碍，为后续机制研究、结构解析和抑制剂开发提供了可操作体系。研究结论可概括为：这项工作增进了对Rce1酶学性质的理解，并为Rce1抑制策略提供了重要见解。