靶向Siglec-1的单域抗体阻断或增强病原体与树突状细胞的结合

《Journal of Biological Chemistry》：Siglec-1-targeting single domain antibodies block or enhance pathogen binding to dendritic cells

　　

Siglec-1（Sialoadhesin/CD169）表达于髓系细胞，是唾液酸的受体，介导与宿主细胞和病原体的黏附。然而，某些病原体利用Siglec-1结合进行进一步传播，干扰该结合可能成为潜在的治疗干预手段。研究人员在此鉴定出高亲和力的单域抗体（亦称为VHHs或Nanobodies），它们能够通过别构或正构方式调节Siglec-1的配体结合。VHH克隆2C2直接结合Siglec-1的配体结合位点，并有效阻断多种配体（如神经节苷脂脂质体、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）和SARS-CoV-2）与单核细胞来源树突状细胞（moDCs）及离体Siglec-1⁺树突状细胞的结合。相比之下，VHH 1B5和1C1结合于配体结合位点之外，并增强了Siglec-1与神经节苷脂脂质体和空肠弯曲菌的相互作用。机制上，VHH 1B5和1C1似乎干扰了Siglec-1表达细胞表面存在的顺式结合唾液酸，从而促进与配体的反式相互作用增强。总之，研究人员分离出结合Siglec-1不同位点的VHH，从而增强或阻断多种唾液酸化病原体的配体结合。此外，与靶向特定病原体的传统阻断抗体不同，结合Siglec-1的VHH可作为广谱病原体阻断剂。

论文解读：靶向Siglec-1的单域抗体对树突状细胞病原体结合的正负调节

研究背景与问题：Siglec-1（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素1，又称Sialoadhesin或CD169）是表达于巨噬细胞和树突状细胞（DCs）表面的Ⅰ型跨膜受体，其胞外区包含一个N端V-set免疫球蛋白配体结合结构域和16个C2-set结构域，通过识别唾液酸（尤其是α(2,3)连接的N-乙酰神经氨酸）介导与宿主细胞及病原体的黏附。Siglec-1能够捕获多种病原体，包括HIV-1、埃博拉病毒、SARS-CoV-2以及脑膜炎奈瑟菌和空肠弯曲菌等。然而，某些病毒（如HIV-1和SARS-CoV-2）会利用Siglec-1介导的捕获进行反式感染邻近细胞，从而促进病毒传播；空肠弯曲菌的唾液酸化脂寡糖模拟宿主神经节苷脂，其通过Siglec-1被巨噬细胞摄取后可能诱导产生交叉反应性自身抗体，导致吉兰-巴雷综合征（GBS）。因此，调节Siglec-1与病原体的结合具有潜在治疗价值。传统阻断抗体通常靶向特定病原体，而靶向宿主受体的广谱阻断策略可能更有效。基于此，研究人员旨在生成靶向人Siglec-1的VHH（重链抗体可变结构域，即单域抗体或纳米抗体），以调节其配体结合功能。

研究内容与总体结论：研究人员通过免疫羊驼构建噬菌体展示文库，筛选出多个结合人Siglec-1的VHH克隆，并重点表征了1B5、1C1和2C2三个克隆。结果表明，2C2直接结合Siglec-1的配体结合位点，能有效阻断神经节苷脂脂质体、空肠弯曲菌和SARS-CoV-2与Siglec-1⁺细胞的结合；而1B5和1C1结合于D1-D2结构域界面，通过干扰Siglec-1的顺式唾液酸相互作用，增强其与配体的反式结合。这些VHH为研究Siglec-1功能提供了新工具，并可能作为广谱病原体阻断剂用于治疗。

主要关键技术方法：研究人员用表达人Siglec-1的细胞和重组蛋白免疫两只羊驼，构建噬菌体展示文库，通过ELISA和流式细胞术筛选VHH。使用表面等离子共振（SPR）测定亲和力。通过AlphaFold3（AF3）预测VHH与Siglec-1的复合物结构，并结合点突变（R97A）和重组结构域蛋白进行表位定位。采用神经节苷脂脂质体结合实验、空肠弯曲菌结合实验、SARS-CoV-2重组刺突蛋白及活病毒结合实验，以流式细胞术和qPCR检测。样本来源包括健康供者外周血单核细胞（PBMCs）来源的moDCs和离体DCs，以及来自Erasmus MC的GBS相关空肠弯曲菌菌株。

研究结果：
1. 免疫策略与Siglec-1结合VHH的筛选：通过羊驼免疫和噬菌体展示，获得86个VHH家族，其中18个克隆与Siglec-1表达细胞（BWSn）结合。选择1B5、1C1和2C2进一步表征，SPR显示1B5和2C2以高亲和力（0.6 nM和7.4 nM）结合，1C1亲和力较低（21 nM）。

2. Siglec-1结合VHH的表位定位：竞争实验表明，1B5和1C1的表位与2C2不重叠，但三者均被阻断抗体7D2抑制；2C2与7-239竞争。ELISA显示2C2结合重组Siglec-1-D1，而1B5和1C1需要D1-D2结构域。AF3模型预测2C2结合配体结合位点，且关键残基R97对其结合至关重要；R97A突变完全消除2C2结合，但不影响1B5和1C1。因此，2C2为配体结合位点正构调节剂，1B5和1C1结合D1-D2界面。

3. Siglec-1结合VHH对配体结合的正构和别构调节：2C2以剂量依赖方式完全阻断GM3脂质体结合（IC50约26 nM），并阻断所有测试的神经节苷脂（GM1、GM3、GD1a、GD3）脂质体；相反，1B5显著增强这些脂质体结合，1C1也呈现增强趋势。这表明VHH可分别作为正构阻断剂和别构增强剂。

4. VHH 1B5可能调节Siglec-1顺式相互作用：用神经氨酸酶去除细胞表面唾液酸后，GM3脂质体和7-239结合增加，说明Siglec-1存在顺式掩蔽。在去唾液酸细胞上，1B5增强GM3脂质体结合的能力显著降低，提示1B5通过解除顺式相互作用增强配体结合。

5. VHH 2C2阻断Siglec-1介导的空肠弯曲菌结合：在Siglec-1过表达THP-1（TSn）细胞上，2C2阻断三种GBS相关空肠弯曲菌菌株（GB14、GB23、GB31）的结合，1B5和1C1增强结合。在moDCs上，2C2显著抑制细菌结合并降低IL-6分泌，而VHH单独不激活细胞。表明2C2可阻断Siglec-1介导的细菌结合及后续细胞因子产生。

6. Siglec-1结合VHH与原代细胞结合：UMAP降维分析显示，1B5、1C1和2C2特异性结合外周血Axl⁺Siglec-6⁺ DC（ASDCs），且2C2阻断该细胞对空肠弯曲菌的结合；DC3和单核细胞的结合不依赖Siglec-1。

7. VHH 2C2阻断Siglec-1介导的SARS-CoV-2结合：2C2阻断重组刺突蛋白与BWSn细胞结合，效果与7-239相当；在TSn细胞和moDCs上，2C2显著抑制活病毒（SARS-CoV-2分离株）的结合，而1B5和1C1无阻断作用。

讨论与结论：研究人员生成了分别以正构或别构方式调节Siglec-1配体结合的VHH。2C2通过直接占据配体结合位点（含关键残基R97）发挥阻断作用，而1B5和1C1可能通过干扰细胞表面顺式唾液酸结合，增强配体反式结合。该研究首次证明Axl⁺ DCs以Siglec-1依赖性方式结合空肠弯曲菌，且2C2可特异性阻断。由于VHH体积小、易工程化改造为多价或双特异性形式，靶向Siglec-1的VHH有望成为广谱抗病原体治疗候选分子。研究结论：分离出的Siglec-1结合VHH能够通过别构增强或正构阻断方式调节配体结合，从而增强或阻断多种唾液酸化病原体的结合；与靶向特定病原体的传统抗体不同，这些VHH可作为广谱病原体阻断剂。