Siglec-7调控线粒体动力学与代谢重编程以抑制人NK细胞细胞毒功能

《Journal of Biological Chemistry》：Siglec-7 orchestrates mitochondrial dynamics and metabolic reprogramming to restrain human NK cell cytotoxic function

　　

自然杀伤（NK）细胞是固有淋巴细胞，通过整合激活性和抑制性受体的信号直接清除肿瘤细胞和病毒感染细胞，其效应功能与细胞代谢紧密耦合。鉴于抑制性受体PD-1可重编程T细胞代谢以塑造功能命运，抑制性受体参与对人NK细胞的生物能量学后果在很大程度上仍未得到探索，尤其是对唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec-7）——一种糖免疫检查点受体——而言更是如此。在本研究中，研究人员探讨了与原代NK细胞和NK-92MI细胞中Siglec-7表达及抗体介导的Siglec-7连接相关的代谢程序和效应功能。Siglec-7POS NK细胞在糖酵解和氧化磷酸化抑制条件下表现出选择性受损的CD107a脱颗粒，而Siglec-7NEG细胞则相对耐受，表明这些亚群之间存在不同的能量布线。通过激动性抗体连接Siglec-7可诱导线粒体分裂，伴随Drp1磷酸化改变、瞬时线粒体去极化以及线粒体呼吸的广泛抑制，同时增强糖酵解能力，这与Siglec-7连接后的双重代谢转变一致。相反，NK-92MI-S细胞中持续的Siglec-7表达与整体增强的线粒体呼吸能力相关，表明持续的Siglec-7表达和激动性抗Siglec-7抗体的短期处理与NK细胞中不同的代谢谱相关。此外，与Siglec-7NEG对应细胞相比，Siglec-7POS NK细胞表现出自噬泡积累增加、增殖减少和凋亡易感性增高。总的来说，这些发现支持Siglec-7状态、线粒体稳态和NK细胞代谢适应性之间的关联，其中Siglec-7NEG细胞保留了代谢稳健的细胞毒表型。

一、研究背景与科学问题

自然杀伤（NK）细胞是固有免疫系统的重要组成部分，通过胚系编码的激活性和抑制性受体库对病毒感染细胞和恶性肿瘤细胞发挥快速细胞毒反应。NK细胞的效应功能与细胞代谢紧密耦合：常规NK细胞主要依赖糖酵解支持脱颗粒和细胞因子产生，而细胞因子诱导或抗原经历的类记忆NK细胞则更依赖氧化磷酸化（OXPHOS）、脂肪酸氧化和线粒体生物发生以维持长期活性。线粒体是协调代谢、分化、细胞死亡和自噬的动态细胞器，其功能通过融合与分裂之间的平衡得以维持。融合由线粒体融合蛋白（MFN1和MFN2）及视神经萎缩蛋白1（OPA1）介导，促进相互连接的线粒体网络以支持氧化能力和细胞存活；分裂则由发动蛋白相关蛋白1（Drp1）调控，与线粒体自噬和线粒体质量控制相关。代谢和线粒体程序的破坏会损害淋巴细胞的存活、增殖和效应活性，尤其在肿瘤和慢性病毒感染等病理条件下更为突出。

抑制性受体日益被认为是淋巴细胞代谢的关键上游调控因子。例如，T细胞上检查点受体PD-1的参与会限制糖酵解活性和线粒体功能，促进代谢耗竭状态。类似原理可能适用于NK细胞。在NK细胞表面丰富表达的众多受体中，唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec-7）已被验证为糖免疫检查点，是细胞免疫治疗的有前景靶点。Siglec-7通过其胞质尾部的两个免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs）招募SHP-1和SHP-2磷酸酶，以响应肿瘤或感染细胞上过表达的唾液酸化聚糖，从而抑制激活信号。尽管已有研究提示Siglec-7在巨核细胞（MKs）中调控线粒体组织和功能，但其在NK细胞中是否与线粒体动力学和代谢相关仍不清楚。本研究旨在探讨Siglec-7表达和参与是否与NK细胞中的线粒体动力学和代谢相关，包括Siglec-7^NEG和Siglec-7^POS亚群在糖酵解与OXPHOS依赖及线粒体特性方面是否存在差异。该论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了多种关键技术方法：利用流式细胞术检测CD107a脱颗粒、线粒体质量（MitoTracker Green FM染色）、线粒体膜电位（TMRE染色）及磷酸化Drp1水平；采用Seahorse XF分析仪进行糖酵解压力测试和线粒体压力测试，分别测定细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）；通过免疫印迹检测线粒体动力学和自噬相关蛋白表达；使用共聚焦显微镜结合ImageJ/Fiji软件的线粒体分析插件进行线粒体形态学定量分析；采用CFSE稀释法评估增殖能力；使用Annexin V/7-AAD染色检测凋亡；使用CYTO-ID试剂盒检测自噬泡。样本来源为健康供体外周血NK细胞（PBNK）以及NK-92MI细胞系及其衍生亚系NK-92MI-S。

三、研究结果

代谢抑制对Siglec-7^POS NK细胞脱颗粒的抑制作用更强

研究人员将外周血NK细胞与K-562靶细胞共培养，在糖酵解抑制剂2-DG和OXPHOS抑制剂寡霉素存在下检测CD107a脱颗粒。两种抑制剂均降低了总NK细胞的脱颗粒水平，且在Siglec-7^POS亚群中的抑制程度大于Siglec-7^NEG亚群。NK-92MI细胞系模型中寡霉素对Siglec-7表达细胞的脱颗粒抑制也更为显著。

Siglec-7^NEG NK细胞表现出更大的线粒体质量和更融合的形态

MitoTracker Green FM染色显示，在外周血NK细胞和NK-92MI细胞中，Siglec-7^NEG细胞的线粒体质量均大于Siglec-7^POS细胞。免疫印迹显示两种细胞系中MFN1、MFN2和Drp1总水平相当，但NK-92MI-S细胞中促分裂性Drp1 Ser⁶¹⁶磷酸化水平升高，而Ser⁶³⁷位点无差异。磷酸化特异性流式细胞术证实Siglec-7^POS细胞在两个模型中均表现出更高的Drp1 Ser⁶¹⁶磷酸化水平。共聚焦显微镜定量分析表明Siglec-7^NEG细胞具有更大、更相互连接的线粒体网络。

QA79介导的Siglec-7连接促进线粒体分裂

用激动性抗Siglec-7抗体QA79处理NK-92MI-S细胞1小时后，线粒体面积、周长、分支连接和分支端点均显著减少。原代NK细胞经QA79刺激后同样观察到线粒体面积、周长、形状因子和分支连接的减少，且这些变化主要发生在Siglec-7表达细胞中。

与Siglec-7表达和QA79连接相关的NK细胞代谢谱差异

Seahorse分析显示，NK-92MI与NK-92MI-S细胞之间的糖酵解参数无显著差异，但NK-92MI-S细胞表现出显著更高的基础呼吸、最大呼吸、ATP产生、备用呼吸能力和质子漏。QA79处理NK-92MI-S细胞1小时后，糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备显著增加，而基础呼吸、最大呼吸、ATP产生、备用呼吸能力和质子漏均显著降低，表明Siglec-7连接诱导了增强糖酵解和抑制线粒体呼吸的双重代谢转变。

Siglec-7表达和QA79连接与NK细胞线粒体膜电位差异相关

TMRE染色显示，在NK-92MI细胞和外周血NK细胞中，Siglec-7^NEG细胞的基线TMRE荧光均显著高于Siglec-7^POS细胞，表明前者具有更超极化的线粒体膜电位（ΔΨm）。FCCP处理后两种亚群的TMRE信号均显著降低并趋于一致。QA79处理NK-92MI-S细胞在5分钟和10分钟时均以剂量依赖性方式显著降低ΔΨm，且该效应主要见于Siglec-7^POS细胞。

Siglec-7^NEG与Siglec-7^POS亚群在自噬、增殖和存活方面的差异

免疫印迹显示NK-92MI-S细胞中LC3B-II和p62水平趋于升高。CYTO-ID染色表明Siglec-7^POS细胞在NK-92MI和外周血NK细胞中均表现出更高的自噬泡阳性细胞频率。CFSE增殖实验显示，在IL-2加IL-15或单独IL-15培养条件下，Siglec-7^NEG NK细胞的分裂指数和扩增指数均高于Siglec-7^POS细胞。Annexin V/7-AAD染色显示Siglec-7^POS细胞在两种模型中均表现出显著更高的总凋亡、早期凋亡和晚期凋亡频率。

四、讨论与结论

本研究表明Siglec-7表达和抗体介导的连接与NK细胞中线粒体动力学、代谢状态和效应功能之间存在关联。Siglec-7^POS NK细胞对糖酵解和OXPHOS的代谢抑制特别敏感，表现出线粒体分裂增加、膜电位改变、自噬增强、增殖停滞和凋亡易感性增高，符合代谢脆弱表型。相比之下，Siglec-7^NEG NK细胞维持更大的线粒体质量和融合形态，在代谢应激条件下保持脱颗粒能力，表明其具有更稳健的能量能力。QA79介导的Siglec-7连接与线粒体呼吸参数降低和糖酵解参数增强相关。值得注意的是，寡霉素对脱颗粒的抑制程度大于2-DG，表明糖酵解和OXPHOS在支持NK细胞脱颗粒的快速能量需求中是功能耦合的。Siglec-7^NEG外周NK细胞在细胞因子刺激下的优先扩增与其代谢适应性一致。与CD8⁺ T细胞中Siglec-7标记非耗竭效应记忆细胞不同，NK细胞中高Siglec-7表达与线粒体碎片化和受损的长期增殖存活相关，表明Siglec-7在不同淋巴细胞谱系中的代谢印记存在差异。结合先前在巨核细胞中的发现，Siglec-7可能在造血谱系中广泛影响线粒体结构和生物能量程序。这些发现为靶向Siglec-7相关线粒体通路以增强NK细胞介导的抗肿瘤免疫提供了基础。