基于碳水化合物介导的硼酸杂合物在细胞水平及胰岛素缺陷斑马鱼中的摄取：活体成像与多光子FLIM的应用

《Advanced Science》：Carbohydrate-Mediated Cellular Uptake of Boronic Acid Hybrids In Cellulo and Insulin-Deficient Zebrafish: Live Imaging and Application of Multiphoton FLIM

　　

理解合成分子探针如何与生物碳水化合物相互作用，对诊疗一体化（theranostics）设计和发现十分关键。研究人员报道了新的超分子多糖复合物，由同时功能化的硼酸（boronic acid）偶联至黄原酮类（xanthene-based）荧光标签，并与葡萄糖或β-D-葡聚糖（β-D-glucan，源自大麦 Hordeum vulgare 的天然产物）等糖类结合。这些杂合物在溶液和细胞环境中利用先进生物物理方法研究，包括多光子荧光寿命成像显微镜（multiphoton fluorescence lifetime imaging microscopy, MP-FLIM）。研究人员还通过将硼酸偶联到核壳 Fe3O4@SiO2 纳米颗粒表面的 ─Si(OH)2 官能团，构建了新型荧光杂化纳米颗粒。利用相关共聚焦与多光子荧光显微镜（2光子激发 910 nm），结合时间相关单光子计数（TCSPC）和 FLIM，研究人员探测了探针环境、与 β-D-葡聚糖的相互作用及细胞背景。通过与标准染料共定位，评估探针穿透细胞及靶向细胞器的潜力；所采用亲脂性连接子（linker）显著影响胞质分布并促进斑马鱼摄取。互补的斑马鱼荧光立体显微镜研究显示，这些复合物在消化系统中的差异摄取与淬灭依赖于外源/内源碳水化合物、葡萄糖或 β-D-葡聚糖浓度。

研究背景方面，硼酸衍生物因低毒性和生物相容性受到关注，可与1,2-或1,3-二醇形成可逆硼酸酯，从而调控荧光并传感糖类、ATP等生物分子。传统酶法葡萄糖传感存在试剂消耗与降解问题，而荧光硼酸探针可在生理条件下连续实时监测葡萄糖。癌细胞表面唾液路易斯X（Sialyl Lewis X）等糖类过表达，β-D-葡聚糖具有免疫激活、抗癌载体潜力，但其与硼酸荧光探针在活细胞及活体水平的摄取机制、微环境响应仍不清楚。某些荧光团会主导摄取和定位、损害选择性，因此研究人员希望将硼酸酯作为交联基元，降低非特异性结合，并借助多光子FLIM解析探针在细胞与斑马鱼中的分布、寿命和环境相互作用。该研究发表于《Advanced Science》。

主要关键技术方法包括：多光子荧光寿命成像显微镜（MP-FLIM）与时间相关单光子计数（TCSPC）用于活细胞探针寿命与微环境解析；共聚焦荧光显微镜与共定位染色评估亚细胞定位；原子力显微镜（AFM）、冷冻扫描电镜（CryoSEM）和扩散序谱（DOSY）表征β-D-葡聚糖聚集与杂化结构；亲和素（avidin）微球/微珠结合实验验证生物素（biotin）介导识别；斑马鱼模型采用4 dpf幼虫及胰岛素突变 ins^bns102 品系（内源高血糖队列）进行体内碳水化合物响应成像。

2.1 溶液中的合成与光谱研究（Synthesis and Spectroscopic Investigations in Solution）：研究人员合成化合物1–6，用核磁、荧光光谱、HRMS-ESI、HPLC表征。荧光滴定显示化合物2与D-葡萄糖结合常数约10⁸ M^?1，与β-D-葡聚糖结合常数高于10⁴ M^?1。AFM与MM+模型表明β-D-葡聚糖为纳米聚集体，硼酸-二醇作用不破坏天然三股螺旋。结论：硼酸荧光探针可与单糖/多糖形成稳定复合物，连接子疏水性改变光物理行为。

2.2 时间相关单光子计数实验（TCSPC Experiments）：在DMSO中以910 nm双光子激发测寿命。化合物1–3、5、6呈双指数衰减，与β-D-葡聚糖结合后平均寿命略降，说明硼酸-葡聚糖结合引起轻微淬灭；化合物4无硼酸，单指数3.48 ns。6@Fe₃O₄@SiO₂ 也呈多指数衰减。结论：寿命“指纹”可反映聚集、结合与环境变化。

2.3 活细胞中多光子FLIM与相关共聚焦显微分析（Multiphoton FLIM and Correlated Confocal Microscopy Assays in Living Cells）：MTT显示短时成像低毒。化合物1、2在37°C胞内寿命升高，4°C因黏度升高寿命分布改变；化合物3定位于线粒体；化合物5、6带生物素与柔性/刚性连接子，可快速穿膜、胞质分布，与溶酶体/线粒体共定位，葡聚糖配方改变摄取路径。结论：亲脂连接子促进摄取，硼酸标签辅助糖类相互作用，FLIM能区分构象与微环境变化。

2.4 化合物1–6与碳水化合物共孵育的斑马鱼体内测试（In Vivo Tests of Compounds 1–6 and Carbohydrate Co-Incubation Assays in Zebrafish）：4 dpf斑马鱼用50 μM 120 min孵育。化合物2、3摄取亮于1；葡萄糖共孵使化合物2淬灭、化合物3增强，葡聚糖无显著淬灭。化合物5、6摄取强且葡萄糖后淬灭。ins^?/^? 突变鱼内源高血糖使化合物2强淬灭，野生型/杂合子信号高。结论：肠道碱性pH、葡萄糖易吸收、葡聚糖难跨膜共同导致消化系选择性标记；硼酸荧光探针可区分外源/内源葡萄糖状态。

讨论部分总结：研究人员指出，荧光强度易受pH、探针自身分布影响，因此MP-FLIM比单纯共聚焦强度更可靠；硼酸探针在细胞中寿命受黏度、温度、蛋白结合、聚集调控，在斑马鱼中肠道为化学与生理交汇界面。该类黄原酮硼酸-葡聚糖杂合物桥接了小分子与生物纳米材料，为癌症相关糖类靶标和无创诊疗提供思路。

结论部分翻译：研究人员合成并评估了多种硼酸功能化荧光团，在活细胞与斑马鱼中证明其膜穿透、器官标记和碳水化合物响应能力；多数化合物在活细胞成功摄取、在斑马鱼消化器官显著标记。细胞水平中，领先荧光素硼酸化合物（尤其1和2）的摄取细节通过共定位与FLIM解析，显示硼酸酯交联可降低非特异性二醇结合；溶液中寿命与细胞内寿命偏移说明探针响应生物分子环境。斑马鱼水平中，葡萄糖但非葡聚糖引起明显荧光变化，ins突变内源高血糖模型证实探针可检测内源葡萄糖升高。新型 6@Fe₃O₄@SiO₂ 杂化纳米颗粒保留磁核壳结构并被细胞摄取。该工作表明，碳水化合物介导的硼酸杂合物可作为活体糖代谢与癌症相关糖表型成像的有前景平台，对下一代葡萄糖监测与早期癌症诊断具有意义。