《Advanced Science》：Engineered Transformer Base Editor with Enhanced Editing Efficiency
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经典的胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）能够在不诱导DNA双链断裂（DSBs）的情况下实现精确的C-to-T转换，但其临床应用潜力仍受到大量脱靶（OT）突变的阻碍。最近开发的Transformer碱基编辑器（tBE）通过使用可切割的脱氧胞苷脱氨酶抑制剂（dCDI）结
经典的胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）能够在不诱导DNA双链断裂（DSBs）的情况下实现精确的C-to-T转换，但其临床应用潜力仍受到大量脱靶（OT）突变的阻碍。最近开发的Transformer碱基编辑器（tBE）通过使用可切割的脱氧胞苷脱氨酶抑制剂（dCDI）结构域，显著降低了基因组和转录组水平的OT突变。然而，其适中的碱基编辑效率限制了更广泛的应用。在本研究中，研究人员通过理性的脱氨酶工程改造并融合尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI）结构域，开发了工程化tBE（etBE）。与亲本tBE相比，etBE表现出显著增强的编辑效率（最高提升35.11倍），同时保持了高编辑保真度和背景水平的OT突变。作为治疗概念验证，研究人员在人源化小鼠模型中评估了靶向前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）（一种公认的心血管疾病治疗靶点）的双腺相关病毒（AAV）递送etBE。该治疗实现了高效的体内碱基编辑（最高35.13%），导致血浆PCSK9蛋白（24%）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平（33%）显著降低，同时仅诱导极少的OT突变。总之，etBE代表了一种高效且特异的碱基编辑平台，在基础研究和临床应用中都具有巨大潜力。
**论文解读：工程化Transformer碱基编辑器（etBE）的高效编辑与低脱靶特性**
**研究背景与科学问题**
CRISPR-Cas系统（如Cas9和Cas12）被广泛用于基因敲除和同源定向修复，但其诱导的DNA双链断裂（DSBs）可触发p53介导的DNA损伤应答、大片段缺失及染色体重排等不良事件。为克服这些限制，胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）通过将APOBEC家族胞苷脱氨酶与酿脓链球菌Cas9 D10A nickase（nSpCas9）和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI）结构域融合，实现了无需DSB的C-to-T定向转换。然而，经典CBEs会诱导显著的基因组和转录组脱靶（OT）突变，严重制约其治疗应用。为解决安全性问题，研究者建立了Transformer碱基编辑器（tBE），其利用小鼠APOBEC3（mA3）的N端催化域（mA3CDA1）和C端抑制域（mA3dCDI）之间的天然调控机制，通过双质粒系统和正交RNA适配体-蛋白招募模块，使脱氨酶仅在靶位点被激活。tBE可将OT突变降至背景水平，但其编辑效率相对较低，限制了进一步应用。因此，该研究旨在通过理性蛋白质工程提高tBE的效率，同时保持其高特异性。
**研究内容与意义**
研究人员采用结构引导和多序列比对（MSA）组合策略，对mA3CDA1进行系统突变筛选。基于AlphaFold 2预测的结构模型，并结合与多个活性CDA同源物的比对，设计并筛选了142个单氨基酸替换，鉴定出18个位于底物结合沟的有益突变。随后，对六个最优突变进行迭代组合，获得四重突变体mA3CDA1(QM3)，其在多数基因组位点显著提高了碱基编辑效率。尽管QM3增强了活性，但也导致插入/缺失（indel）频率升高和产物纯度下降。为此，研究人员将单个UGI结构域融合至nSpCas9的C端，有效恢复了编辑保真度，最终构建了工程化tBE（etBE），其组成为nSpCas9-UGI和tBE-V5-mA3(QM3)。etBE在多个细胞系和位点中均表现出显著高于亲本tBE的编辑效率，同时维持极低的OT突变。更重要的是，双腺相关病毒（AAV）递送etBE靶向人源化小鼠的PCSK9基因，实现了高效的体内编辑，并显著降低血浆PCSK9和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，证明其治疗潜力。该研究发表于《Advanced Science》，为碱基编辑领域提供了兼具高效性与安全性的新型平台。
**主要关键技术方法**
该研究使用了以下核心技术：AlphaFold 2结构预测结合MSA的理性蛋白质设计；靶向深度测序（NGS）结合CRISPResso2分析编辑效率、indel频率和产物纯度；RNA测序（RNA-seq）和RADAR流程评估转录组水平的RNA编辑事件；CESSCO（共表达金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌Cas9同源物）检测非sgRNA依赖的基因组OT突变；双AAV8载体系统递送etBE至人源化B6-hPCSK9小鼠（8周龄雌性）的肝脏。
**研究结果**
**2.1 mA3CDA1中有益替换的理性设计**
通过AlphaFold 2预测结构并比对同源CDA，研究人员在mA3CDA1的催化口袋设计并构建了142个突变体。在HEK293T细胞的DNMT3B和MAGEA1-a位点进行筛选，鉴定出18个位于底物结合沟（loop 1、3、5、7）的有益替换，这些突变显著提高了C-to-T编辑效率，其中N133R提升最为显著。
**2.2 组合工程产生四重突变体**
对筛选出的六个最佳突变（G34R、D41E、N69G、E107R、N133R、D136K）进行系统组合。在CUL3和EMX1非NGG位点评估后，四重突变体mA3CDA1(QM3)（D41E/E107R/N133R/D136K）在12个非NGG PAM和14个NGG PAM位点中表现出稳健且优异的编辑活性，平均效率显著高于野生型。
**2.3 mA3CDA1(QM3)脱氨酶变体综合评估**
将QM3和野生型mA3CDA1分别嵌入经典BE4max架构中，在HEK293T细胞12个位点比较发现，QM3-BE4max平均编辑效率为32.16%，显著高于野生型（17.10%），并与rA1-BE4max和CBE6a相当。将mA3dCDI与QM3融合后，编辑活性被有效抑制，表明QM3仍保留对抑制域的敏感性。RNA-seq分析显示QM3未增加RNA编辑事件。结构分析提示，QM3通过增加底物结合口袋的正电荷（如N133R）增强与DNA的静电相互作用，从而提高效率。
**2.4 融合单个UGI结构域至nSpCas9 C端恢复编辑保真度**
虽然tBE(QM3)效率更高，但其indel频率（7.07%）高于tBE（2.99%），产物纯度降低。研究人员测试了多种UGI融合方式，其中将单个UGI融合至nSpCas9 C端（Combo 1）可显著降低indel频率至tBE水平，并提高产物纯度（93.94% vs. 91.42%），同时保持甚至增强编辑效率。该组合被命名为etBE。
**2.5 etBE编辑性能综合表征**
在29个内源NGG PAM位点中，etBE平均C-to-T编辑效率从tBE的17.05%提升至25.16%，indel频率与tBE相当，产物纯度更高。etBE的编辑窗口从9nt拓宽至11nt，并在PAM远端、经典窗口和PAM近端均实现效率提升。在HeLa和N2a细胞中，etBE效率也显著高于tBE。与BE4max和CBE6a比较，etBE效率高于BE4max且与CBE6a相当。此外，将hsgRNA spacer从20nt缩短至10nt可有效消除hsgRNA位点的非预期编辑。
**2.6 etBE诱导的基因组和转录组OT突变评估**
sgRNA依赖性OT分析显示，tBE和etBE在预测的OT位点仅产生背景水平的突变，而BE4max和CBE6a则诱导显著编辑。CESSCO检测非sgRNA依赖性OT突变时，etBE在四个R-loop位点的编辑频率接近对照，远低于BE4max。RNA-seq分析中，etBE组的RNA编辑事件总数（平均1582）与未转染对照（1586）无差异，表明转录组OT突变处于背景水平。
**2.7 双AAV介导的etBE体内碱基编辑**
在人类PCSK9基因人源化的B6-hPCSK9小鼠模型中，通过尾静脉注射双AAV8载体（总剂量2×10
14 vg/kg）。4周
