Parallel comparison of secondary disinfection strategies for controlling bacterial regrowth and antibiotic resistance gene enrichment

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Parallel comparison of secondary disinfection strategies for controlling bacterial regrowth and antibiotic resistance gene enrichment

　　

关于采用二次消毒剂与非消毒饮用水分配系统（DWDS）的相对优劣一直存在争议，但由于缺乏直接比较，导致结论存在偏倚。研究人员运行了三套实验室规模的DWDS，将经过相同初级消毒（氯化处理）的水分别供给氯化系统、氯胺化系统和非消毒系统（对照组）。研究人员允许氯（胺）浓度下降，以模拟系统中残留浓度较低的区段。初级消毒按推荐的CT值进行，降低了ATP浓度，但增加了抗生素抗性基因（ARGs）并筛选出了耐氯菌属，包括假单胞菌属（Pseudomonas）。二次消毒对群落进行了进一步亚筛选，导致细菌和标准化ARG（每千碱基每百万映射读段的读数 - RPKM）富集模式出现显著差异。在氯化系统和氯胺化系统中，ARG富集与多重耐药菌属的选择和生长相关。多重耐药菌属鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）在所有系统中均持续存在。在对照系统中，观察到最高的细菌再生长，包括机会病原体（OPs），但这并未导致ARG富集。外排泵是所有系统中最主要的耐药机制。靶点保护和靶点改变在氯胺化系统中水平相当。表达的耐药类别（主要是大环内酯类）与进水一致，尽管各系统中的相对丰度有所变化。利福霉素耐药性在氯胺化系统中被选择性富集。毒力因子基因（VFGs）随ATP浓度的升高而增加。对于相同的进水，所测试的二次消毒剂均未能消除所有潜在风险，尽管氯胺化系统表现相对最佳。本研究突显了初级消毒要求的不足以及二次消毒管理中需关注的领域。

论文解读：二次消毒策略对控制饮用水分配系统中细菌再生长与抗生素抗性基因富集的平行比较

研究背景与目的

历史上，消毒技术成功消除了水媒疾病。饮用水消毒通常分为两步：初级消毒旨在灭活水源性病原体，而二次消毒则用于减少水在储存和分配过程中的污染。然而，随着消毒剂在管网末梢消耗殆尽，细菌会再次生长，其中一些再生的细菌可能是机会病原体（OPs），并且可能携带抗生素抗性基因（ARGs）。鉴于世界卫生组织已将ARG传播列为重大公共卫生威胁，理解饮用水分配系统（DWDS）中的细菌再生长和ARG动态至关重要。目前，关于哪种二次消毒剂（如氯、氯胺）或不投加消毒剂的系统能带来最低的总体微生物健康风险，仍存在广泛争论。以往的研究多基于纯培养物暴露于消毒剂的实验，或是在不同水源和处理工艺的全尺度系统中进行对比，缺乏在统一基线条件下对多种二次消毒策略的直接平行比较。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过可控的实验室规模系统，直接比较氯化、氯胺化和非消毒系统在控制细菌再生长、ARG富集及毒力因子基因（VFGs）方面的效果，以填补这一关键知识空白。该论文发表在《Journal of Environmental Chemical Engineering》。

主要关键技术方法

研究人员采用了三套平行运行的实验室规模反应器系统来模拟DWDS条件。首先，采集经混凝、砂滤处理的河水作为进水，在初级消毒池中进行氯化处理。随后，将同一批初级消毒后的水分流至三个独立的二次消毒系统：氯化系统（Cl）、氯胺化系统（Cm）和非消毒对照组（Ctrl）。每个系统由三个串联的反应器（R1至R3）组成，总水力停留时间约为5.5天。研究人员通过调整化学药剂投加量，在各系统的R1维持目标消毒剂浓度，并在后续反应器中允许其自然衰减，以模拟实际管网中从高残留到低残留的梯度。研究期间，通过测量ATP浓度来指示微生物活性，并使用鸟枪法宏基因组测序对收集的水样进行微生物群落结构、ARGs和VFGs的分析。ARG丰度通过每千碱基每百万映射读段数（RPKM）进行归一化。数据分析使用了SqueezeMeta流程进行物种分类，RGI-BWT软件比对综合抗生素抗性数据库（CARD）进行ARG定量，并利用毒力因子数据库（VFDB）注释VFGs。

研究结果

3.1 实验室规模反应器系统的运行特性

研究发现，初级消毒达到了推荐CT值，使ATP浓度平均降低约10倍，但细菌多样性未受显著影响。在氯化系统和氯胺化系统中，随着水流向末端反应器（R3），消毒剂残留降低，ATP浓度随之上升。相比之下，非消毒对照组在整个系统中都表现出更高的ATP水平和微生物活性。主坐标分析显示，不同消毒方式的微生物群落结构存在显著分离，且消毒剂残留浓度是驱动群落分化的额外重要因素。

3.2 消毒剂模式塑造了微生物群落结构

初级消毒虽降低了ATP，但筛选出了耐氯菌属，如假单胞菌属（Pseudomonas）和潘多拉菌属（Pandoraea）。二次消毒施加了更强的选择压力。在氯化系统中，高游离氯浓度下微生物活性极低，但下游低氯区域（Cl-R2）出现了潘多拉菌属（Pandoraea）的极度富集（占85%）。在氯胺化系统中，则富集了分枝杆菌属（Mycolicibacterium）、甲基杆菌属（Methylobacterium）等生物膜形成菌群。非消毒对照组保持了最高的香农多样性和更均匀的群落结构，但鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）等耐氯菌属同样成为优势菌。

3.3 氯化增加了耐氯和耐抗生素细菌的再生潜力

在非消毒对照系统中，细菌再生程度超过了进水，这可能源于初级消毒产生的可生物降解溶解性有机碳（BDOC）以及特定微生物在无竞争环境下的快速增殖。在氯化系统中，低游离氯浓度（~0.12 mg/L）的Cl-R3也观察到了显著的细菌再生长。

3.4 消毒剂介导的群落选择潜在地影响了ARG动态

初级消毒后，ARG丰度（RPKM）增加了约3倍，主要由假单胞菌属等携带外排泵机制的耐氯菌驱动。在氯化系统中，高游离氯的Cl-R1使ARG丰度降至最低，但下游Cl-R2因潘多拉菌属的爆发式增长导致ARG丰度激增约7倍，外排泵仍是主要机制，同时抗生素失活机制贡献增加。在非消毒对照组，尽管细菌数量大增，ARG丰度反而下降，表明消毒剂诱导的应激是ARG富集的关键驱动力。在氯胺化系统中，细菌再生长速度超过了ARG扩增速度，呈现出更均衡的耐药机制结构（外排泵、靶点保护、靶点改变）。大环内酯类和氟喹诺酮类耐药在所有样品中普遍存在，而利福霉素耐药性在氯胺化系统中被选择性富集。

3.5 消毒剂或群落选择对毒力因子基因动态的影响较小

VFGs的总丰度变化与ATP浓度呈正相关，而非与ARGs的变化趋势一致。这表明VFGs的富集主要由微生物总量的增长驱动，而非特定的消毒剂筛选或群落结构转变。

3.6 消毒剂暴露选择性富集了机会病原体

在所有系统中均检测到了机会病原体（OPs），但其相对丰度均低于0.1%。非消毒对照组和氯胺化系统末端反应器（Cm-R3）的OPs数量（以ATP衡量）更高。不同消毒方式筛选出的OPs种类各异。例如，Pseudomonas aeruginosa在氯化系统中相对丰度更高，而多种非结核分枝杆菌（NTM）则在氯胺化系统中更为丰富。这证实了消毒剂类型和浓度对OPs群落组成具有选择性作用。

结论与讨论

研究表明，即使达到推荐的初级消毒CT值，也无法完全阻止DWDS中ARGs的扩散和细菌的再生长。二次消毒策略的选择决定了微生物群落的结构，进而深刻影响了ARGs和VFGs的动态。没有任何一种单一的二次消毒策略能完全消除所有潜在风险。对于相同的进水，氯胺化系统在平衡细菌再生长、ARG富集和OPs控制方面表现相对最优，但其本身也会选择性富集某些特定的耐药机制和病原体（如利福霉素耐药和分枝杆菌）。

研究结论指出，初级消毒的要求可能存在不足，并强调了二次消毒管理需要关注的重点领域。未来的改进策略可能包括：增强初级消毒（如使用臭氧或紫外线），但同时需警惕由此增加的BDOC；或在消毒前进行深度过滤以去除细胞，但成本较高且无法清除胞外ARGs。此外，去除营养物质（如BDOC或磷）也是抑制细菌再生长的潜在途径。该研究的局限性在于其基于水体样本的分析，未能直接评估生物膜的贡献，而生物膜是DWDS中ARGs和微生物的重要储库。因此，未来的研究应结合对细胞内和胞外ARG组分的定量分析，并探索不同初级与二次消毒组合的效果。