《Advanced Science》：Periostin-CCL3 Feedforward Signaling Loop Promotes Cardiac Fibrosis and Cardiomyocyte Necroptosis in Arrhythmogenic Cardiomyopathy
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Periostin（POSTN）是一种在心血管疾病中发挥多重功能的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白。然而，其在致心律失常性心肌病（arrhythmogenic cardiomyopathy，ACM）中的作用仍不清楚。本研究中，
Periostin（POSTN）是一种在心血管疾病中发挥多重功能的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白。然而，其在致心律失常性心肌病（arrhythmogenic cardiomyopathy，ACM）中的作用仍不清楚。本研究中，研究人员证实POSTN在ACM小鼠及患者心肌中显著升高。POSTN缺失可减轻ACM小鼠心脏功能障碍、减少心脏纤维化并提高生存率。POSTN主要来源于心脏肌成纤维细胞，并在体内外促进心肌细胞坏死性凋亡（necroptosis）。机制上，POSTN通过integrin-JNK-RIP3-MLKL信号促进心肌细胞坏死性凋亡，并通过integrin-JNK-ETS2通路诱导CCL3表达。反过来，CCL3通过NF-κB信号激活心脏肌成纤维细胞并刺激POSTN表达。研究人员发现，POSTN与CCL3通过心肌细胞中的POSTN-integrin-JNK-ETS2-CCL3信号，以及心脏肌成纤维细胞中的CCL3-CCR5-NF-κB-POSTN轴推动ACM进展。研究人员进一步发现，药理抑制JNK或CCR5以靶向JNK-CCL3-CCR5轴，可通过抑制心脏纤维化与心肌细胞坏死性凋亡减轻小鼠ACM进展。因此，靶向POSTN-CCL3前馈信号环路可为ACM患者提供新的治疗策略。
《Advanced Science》发表的该研究围绕致心律失常性心肌病（arrhythmogenic cardiomyopathy，ACM）中Periostin（POSTN，一种细胞外基质蛋白）与CCL3（趋化因子配体3）的病理作用展开。ACM是一种以心律失常和心肌结构异常为特征的遗传性心肌病，桥粒（desmosome，细胞间连接结构）基因如DSP、PKP2、JUP、DSC2、DSG2突变与其密切相关。目前ACM中POSTN的作用和机制尚不清楚。研究人员以心肌限制性DSP敲低小鼠和ACM患者心肌组织为对象，证明POSTN在ACM中显著上调，主要源于心脏成纤维细胞/肌成纤维细胞，并可促进心肌细胞坏死性凋亡与纤维化。研究核心结论是：POSTN经integrin-JNK-RIP3-MLKL轴诱导心肌细胞坏死性凋亡，经integrin-JNK-ETS2轴诱导CCL3；CCL3再经CCR5-NF-κB轴激活肌成纤维细胞并上调POSTN，形成POSTN-CCL3前馈环路放大病理重塑。靶向JNK或CCR5可减轻ACM进展，为治疗提供新思路。
作者开展研究用到的主要关键技术方法包括：构建心肌限制性DSP条件敲低ACM小鼠模型；利用AAV9-Tcf21-Cre实现心脏成纤维细胞特异性Postn缺失；分离成年小鼠心肌细胞（cardiomyocytes，CMs）与非心肌细胞（non-cardiomyocytes，NCMs）、新生小鼠心肌细胞与心脏成纤维细胞进行体外实验；采用间接共培养体系研究心肌细胞与成纤维细胞互作；通过RNA测序（RNA-seq）筛选差异基因；使用小干扰RNA（siRNA）敲低DSP、Itgβ3、Itgβ5；应用integrin中和抗体及JNK、CCR5、NF-κB通路抑制剂；以人ACM患者心肌标本与正常对照进行免疫组化、免疫荧光及RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）验证；样本队列来源于阜外医院伦理委员会审批的人体标本及厦门大学动物中心小鼠模型。
2.1 POSTN在ACM小鼠心肌中高度升高：研究人员通过mRNA、蛋白、免疫组化与免疫荧光检测，发现DSP-ACM小鼠心肌与血清中POSTN显著升高，且POSTN主要积聚于纤维化区域，来源于vimentin阳性心脏成纤维细胞而非脂肪细胞、巨噬细胞或内皮细胞，RNA-FISH进一步确认Postn mRNA与Vimentin共定位。
2.2 POSTN缺失改善ACM小鼠心脏功能与生存：研究人员通过全局Postn缺失及成纤维细胞特异性Postn缺失发现，POSTN缺失可减轻心肌丢失、降低Nppa与Nppb等心衰标志基因、改善心电图T波改变、提升左室射血分数（EF%）与短轴缩短率（FS%）、增加运动耐量、降低心重/胫骨长比值，并显著提高生存率；电镜显示桥粒超微结构缺陷未被完全修复。
2.3 POSTN缺失减轻ACM小鼠心脏纤维化：研究人员通过Masson、天狼星红、免疫组化、Western blot与qRT-PCR证明，POSTN缺失降低胶原沉积、α-SMA与Col1a1表达，并下调Acta2、Col1a1、Col3a1、Tgf-β3、Fn1、Ctgf、Mmp2、Mmp9等纤维化相关基因，成纤维细胞特异性缺失Postn亦得到一致结果。
2.4 POSTN通过integrin-JNK-RIP3-MLKL轴诱导心肌细胞坏死性凋亡：研究人员发现POSTN单独不足以诱导坏死性凋亡，但在DSP敲低背景下rmPOSTN/rhPOSTN可升高p-RIP3、p-MLKL与LDH；integrin αvβ3/αvβ5中和抗体、Itgβ3/β5敲低、MAPKK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125、坏死性凋亡抑制剂Nec-1可逆转该过程，证明POSTN结合integrin激活JNK，进而促进RIP3与MLKL磷酸化。
2.5 POSTN通过integrin-JNK-ETS2信号促进心肌细胞CCL3表达：RNA-seq显示Postn缺失后Ccl3下降；CCL3主要源于cTNT阳性心肌细胞。rmPOSTN/rhPOSTN在DSP敲低心肌细胞中上调ETS2（E26 oncogene homolog 2，转录因子）与CCL3；integrin阻断或JNK抑制可降低二者，双荧光素酶报告证明ETS2转激活Ccl3启动子，而Nec-1不影响ETS2，说明该轴位于坏死性凋亡上游。
2.6 CCL3-CCR5-NF-κB信号诱导心脏成纤维细胞活化与POSTN表达：研究人员发现ACM心肌Ccr5上调；rmCCL3以时间剂量依赖方式促进新生小鼠心脏成纤维细胞Acta2与Postn表达；CCR5抑制剂Maraviroc可逆转该效应。体内外实验显示CCL3通过CCR5升高ILK与p-P65，NF-κB抑制剂BAY-11-7082抑制α-SMA与POSTN，证明CCL3-CCR5-NF-κB-POSTN构成回馈环路。
2.7 POSTN与ACM小鼠及患者心肌细胞坏死性凋亡和CCL3上调正相关：研究人员以正常对照与ACM患者心肌进行Masson、Perilipin、p-MLKL、POSTN、CCL3、cTNT染色及Ccl3 RNA-FISH，确认ACM中POSTN升高伴纤维化、脂肪替代、p-MLKL与CCL3上调，且CCL3来自心肌细胞；小鼠实验显示POSTN缺失后p-RIP3、CCL3与POSTN空间共定位增强现象消失。
2.8 靶向JNK-CCL3-CCR5轴减轻ACM小鼠心脏重塑与坏死性凋亡：研究人员发现4月龄小鼠尚未出现明显环路激活，8月龄显著激活，说明该环路非ACM起始因素而是进展期放大环路。5月龄ACM小鼠分别用Maraviroc与SP600125治疗3个月，均改善病理形态、降低Nppa/Nppb、减轻纤维化、降低LDH与p-RIP3/p-MLKL、抑制JNK-ETS2-CCL3信号，效果与Postn缺失一致。
讨论部分总结：研究人员指出，ACM中心肌细胞死亡方式除凋亡、自噬外，坏死性凋亡是被低估的关键机制；POSTN经integrin-JNK-RIP3-MLKL促进坏死性凋亡，并经integrin-JNK-ETS2-CCL3驱动成纤维细胞活化，CCL3-CCR5-NF-κB-POSTN再放大纤维化，形成心肌细胞与成纤维细胞间前馈环路。该模型为DSP缺失型ACM，是否适用于其他桥粒基因突变仍需验证；CCL3主要源于心肌细胞，但心肌细胞特异性Ccl3缺失的功能必要性尚未证明。靶向JNK或CCR5可打断细胞间病理对话，具治疗潜力。
结论部分翻译：本研究证实了心肌细胞坏死性凋亡与成纤维细胞活化在ACM病理重塑中的重要作用。POSTN与CCL3介导的两种细胞互作促进心肌损伤与纤维化，建立可放大疾病进展的前馈信号环路。药理靶向JNK或CCR5可减轻ACM小鼠心脏重塑与坏死性凋亡，支持干预POSTN-CCL3相关信号网络的治疗潜力。
