通过补料分批式混合营养培养斜生栅藻，耦合同步生物修复与高油脂生产制备优质生物柴油

《Journal of Environmental Management》：Coupling simultaneous bioremediation with high lipid production for quality biodiesel via mixotrophic cultivation of Scenedesmus obliquus in fed-batch

　　

摘要
可持续生物燃料和复杂工业废水的修复是全球水-能纽带中面临的关键挑战。本研究探索了一种新型策略，利用预驯化斜生栅藻进行混合营养补料分批培养，以实现同步生物修复和高品质生物柴油生产。一种旨在维持恒定生物量与底物比准稳态的恒定比生长速率制度被评估，并与线性进料模型和传统连续恒化器培养进行了比较。为模拟极端环境条件，配制了10倍浓缩培养进料，包括空气中的连续CO2、葡萄糖和甘油补充，以及重金属、碳酸氢盐、合成海水和Najafgarh排水口废水。所开发的补料分批策略在改进的152-192小时时间范围内实现了81.53 ± 0.08 g/L的最大干细胞重量和88.70 ± 0.08 %（g/g）的总脂质含量，在补料分批和恒化器中分别达到了0.495 g/L/h和0.181 g/L/h的最高脂质生产率，展示了高品质脂质生产。该系统对重金属和碳酸氢盐的生物修复效率超过97%。对酯交换脂质的气相色谱-质谱分析显示，脂肪酸甲酯组成以C16:0和C18:1为主。生物柴油特性显示十六烷值为60.024，高位热值为39.933 MJ/kg，比重为0.877 kg/L，运动粘度为4.399 cSt，碘值为68.141（g I2/100 g油），浊点为9.379 °C，符合EN-14214和ASTM-D6751国际生物柴油标准。通过将同步生物修复与高脂质生产相结合，这种整合方法呈现了一种高度可扩展、可持续的范式，直接推动了联合国可持续发展目标6、7、9、12和13。

引言
全球对日益减少的化石燃料资源需求的增长，与日益严重的淡水短缺和环境退化相关联，对水-能纽带造成了重要制约。在印度，这种情况甚至更具挑战性。一方面存在对外国原油进口的经济依赖，同时由于广泛的工业化和城市化进程，水资源污染相当严重。不断排放含有危险重金属的复杂废水和未经处理的市政污水废物，进入日益减少的淡水资源储备中。解决这些内在交织的挑战需要开发一种协同生物过程，能够同时实现高效资源回收和强大的环境生物修复。

微藻生物技术作为一种双重作用平台，已显示出在同步废水处理和生产第三代生物燃料方面的巨大前景。过去，连续和补料分批过程主要被用于大规模应用，每种过程都有其固有的生物限制。连续培养过程维持稳定的生物量生长速率，但通常无法产生最大脂质生产所需的细胞内应激条件。而传统补料分批操作以富含营养物的批次培养生长阶段开始，然后在准稳态下切换至接近营养物饥饿环境以诱导脂质形成。氮胁迫能有效上调脂质生物合成，但不可避免地抑制细胞分裂，导致总体生物量积累与终端脂质产量之间的严重权衡。最近的研究表明，策略性碳补充可减轻生长惩罚，然而实现高体积生产率仍受到长期且不经济可行的培养周期的严格制约。

本研究提供了改进的补料分批培养操作设计，利用连续恒化器操作的基础数据而非传统批次培养数据，以规避这些限制。取决于批次培养中的瞬态状态，由于环境条件快速变化，真实代谢潜力可能无法显现，而恒化器操作允许精确的代谢通量分析。通过映射细胞内代谢通量途径，识别负责碳分配的活动代谢途径。基于代谢通量途径分析的策略提供了选择最高效比生长速率（μ）的机会，该速率直接控制向长链脂肪酸生物合成的代谢通量，最终形成优质生物柴油前体。将定义的代谢途径从恒化器过程转换为动态补料分批操作，为最大目标脂质生成提供了深刻蓝图。基于补料分批培养过程的代谢通量有效性取决于用于营养物进料的动力学。非计划的间歇进料由于营养物饱和和耗竭的波动扰动，在细胞内产生非稳态反应，从而影响代谢途径效率。线性进料提供连续营养物流，但由于生物量增加，固定进料速率成为比生长速率持续增加的障碍，导致生物量与脂质生产之间的对抗性权衡。在精确控制进料中，通过持续调节营养物流入以匹配培养物的指数生长，建立准稳态。先进的动力学模型维持恒定的比生长速率（μ）和稳定的生物量与底物比（X0/S0）。这确保了底物的完全利用，无细胞内碳抑制或溢出。从理论上优化了细胞内通量，实现同步生物量生长和代谢物积累。尽管近年来在生物反应器操作方面取得了所有进展，微藻生物技术中普遍存在的教条认为，延长环境胁迫阶段对最大脂质生产是必需的。本研究致力于开发一种新型"恒定比生长速率"补料分批操作制度。代谢通量分析框架得出的见解表明，延长营养物缺乏导致系统生理耗竭，而非脂质分配优化。为了实现更高的脂质生产率和高品质生物柴油，系统中延长的培养或饥饿期变得不必要。通过精确控制进料实施营养控制，碳通量被有效导向快速脂质积累，而不损害细胞活力。

本研究的主要目标在于验证使用高度强健的淡水微藻斜生栅藻NCIM5526进行的混合营养补料分批操作。该方法的创新性由其特定的进料输入和多胁迫适用性定义。首先，它利用多底物协同的代谢途径，在混合营养下整合连续甘油共进料与主要碳源。这种特定的代谢途径操作旨在从根本上理解中央碳代谢，产生过量还原当量以增强脂质生产。其次，该系统利用预驯化培养进行同步多胁迫生物修复。为了创建严格的极端工业基质，配制了10倍浓缩培养进料，以实现重金属、无机碳酸氢盐、高盐合成海水（类似于反渗透浓水）和未经处理的Najafgarh排水口废水的同步生物修复。将多胁迫生物修复与增强的第三代生物燃料生产相结合，这种整合生物工艺直接符合联合国可持续发展目标。特别地，来自废水的多胁迫生物修复和强健营养物利用能力推动了可持续发展目标6（清洁水和卫生），复杂废物流的完全利用转化为有价值的生物产品支持可持续发展目标12（负责任消费和生产），产生符合国际标准（ASTM D6751和EN 14214）的高品质生物柴油符合可持续发展目标7（经济适用的清洁能源），以及无机碳酸氢盐的活跃生物固存对可持续发展目标13（气候行动）做出了实质贡献。

材料与方法
本研究的实验方法旨在有效分析补料分批中动态进料约束下多胁迫生物修复和高品质脂质生物合成的协同能力。

用于进料策略确定的连续培养基线动力学
同步生物修复和高脂质生产的有效结合取决于受控的补料分批生物工艺操作。向广泛控制的补料分批生物工艺的无缝过渡从根本上依赖于确定接种物最佳生理状态的能力。为建立提高生产率的补料分批操作条件，在六个不同稀释率下进行了初始连续恒化器模式运行。

经济-环境协同和联合国可持续发展目标影响
利用斜生栅藻开发的精确控制混合营养补料分批生物工艺显示出作为循环生物经济平台的巨大潜力。精确控制的补料分批平台通过成功解耦脂质生物合成与微藻培养中典型的高成本、耗时的饥饿阶段，建立了一个高度协同的经济-环境模型。该系统的主要技术经济优势在于其多重……

结论
本研究开发了一种改进的补料分批生物工艺，通过使用预驯化斜生栅藻，高效地将多胁迫废水生物修复与增强的脂质生成整合在一起。基于恒化器系统的稳态数据，采用了一种准稳态控制方法，以实现生长速率的最优调控，从而有效解耦细胞内脂质合成与传统的饥饿阶段。

CRediT作者贡献声明
Vishwender Pratap Singh：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、软件、方法论、调查研究、正式分析、数据管理、概念构思。Aradhana Srivastava：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法论、资金获取、正式分析、概念构思、调查研究。Arinjay Kumar：写作——审阅与编辑、调查研究。

伦理标准遵守情况
本研究不涉及人类和动物参与实验。

资助
本研究未获得公共、商业或非营利部门资助机构的任何特定资助。

利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢
作者感谢德里古鲁戈宾德辛格因德拉普拉斯塔大学研究与开发中心提供的FRGS支持。

Vishwender Pratap Singh | Aradhana Srivastava | Arinjay Kumar
印度德里古鲁戈宾德辛格因德拉普拉斯塔大学化学技术学院，第16C区，Dwarka，新德里，110078，印度