基于关键降解基因对假单胞菌 BO3-4 原位生物强化过程的分子追踪

《Journal of Environmental Management》：Molecular tracking of the in-situ bioaugmentation process of Pseudomonas sp. BO3-4 using key degradation genes

　　

# 摘要

原位生物强化技术通常受到环境因素不明确和微生物活性难以追踪的制约，限制了地下水修复的效率。本研究开发了一种基于功能基因的方法，用于追踪甲苯污染地下水现场规模生物强化过程中的微生物降解活性。基于转录组学分析，选取了 *todC1*（双加氧酶）和 *todE*（开环酶）作为分子标志物，原因是在假单胞菌BO3-4菌株中，这两个基因在甲苯降解过程中发挥关键作用且表现出高度上调（>700倍）。在生物强化结合间歇曝气处理后，这些基因的绝对丰度增加至2.3–2.5 log拷贝/mL，与菌株BO3-4的增殖（相对丰度67.93%–71.13%）密切相关。甲苯去除率达到91.3%–94.6%，相较于先前仅曝气阶段提高了五至六倍，且其去除率与功能基因丰度的正相关关系验证了这些标志物作为生物修复效果稳健定量指标的价值。观察到中间代谢物（苯甲醇、邻甲酚、间甲酚）的积累与后续降解过程，且随着污染减轻，微生物群落得到恢复，表明生态扰动最小化。生物强化后，溶解氧（DO）从3.09–3.12 mg/L降至1.37–2.00 mg/L，冗余性分析表明DO是调控降解活性的关键因素。本研究验证了功能基因标志物并确定了DO作为追踪和优化地下水原位生物强化的关键因素。

# 引言

近年来，运营型石化企业污染场地的修复日益受到关注。2023年，为进一步加强这些在运营工业设施的土壤和地下水污染治理，中华人民共和国（PRC）生态环境部指定12家运营型石化企业作为试点单位，启动了综合试点项目，使污染防控与修复能够与正常生产同步进行（南通市人民政府，2024）。在受污染运营型化工厂中，设施和管线的复杂性对修复工作构成了重大挑战。修复必须在不停产的前提下进行，从而对低扰动、高安全性和可持续性技术提出了需求。传统修复方法，如土壤气相抽提、空气吹脱和化学氧化等，往往伴随高能耗和污染物反弹的风险（Alazaiva等，2022）。原位生物强化技术作为一种绿色、低碳、可持续且具有较高性价比的修复策略，引起了广泛关注，并已成为处理BTEX化合物污染地下水的核心技术之一（Mekontchou等，2024）。然而，由于地下水环境如同一个"黑箱"，原位生物强化的效果只能通过替代指标来推断。仅依赖单一指标（如污染物浓度）无法反映微生物的降解活性，从而限制了过程的及时优化，并导致现场应用中经常观察到的效率低下问题（Romantschuk等，2023）。

甲苯是化学制造过程中的重要原料，年产量约为1360万吨（Holmes和Murray，2024）。然而，许多历史悠久化工企业中地下储罐、运输管线及其他设备维护不当，导致甲苯泄漏，对人民健康和环境构成了严重威胁（Rajasekhar等，2020）。Rajasekhar等（2020）报道，在印度金奈北部地下管线泄漏点附近的地下水中，甲苯浓度最高达3020 μg/L。Aleku等（2024）调查了尼日利亚地下输油管道附近地下水中的苯浓度，在两个采样点的最大值分别为3904 μg/L和3500 μg/L。长期暴露于甲苯污染环境中可能导致居住在污染场地附近的人群出现肾毒性和中枢神经系统功能障碍（Saeedi等，2024）。泄漏进入地下水的甲苯沿地下水流向迁移，扩大污染羽范围，增加运营型化工厂的修复成本（Nassery等，2024）。

由于在有氧条件下甲苯的代谢效率和矿化程度高于厌氧途径，近期研究越来越多地关注外源好氧菌的应用（Sarkar等，2020）。好氧降解菌通过加氧酶催化对苯环的攻击来启动芳香烃的分解——这一过程被广泛认为是整体降解过程中的限速步骤（Chen等，2021；Erickson等，2022）。在甲苯降解过程中，不同菌株表现出不同的羟基化区域选择性。芽孢杆菌G4和伯克霍尔德氏菌PKO1分别利用甲苯2-单加氧酶（T2MO）和甲苯3-单加氧酶（T3MO）在芳香环的特定位点进行羟基化，生成邻甲酚和间甲酚（Yoshikawa等，2017）。恶臭假单胞菌mt-2的TOL质粒上编码的二甲苯单加氧酶（XMO）催化甲基侧链的羟基化，生成苯甲醇（Worsey和Williams，1975）。相比之下，从石化污染场地分离的假单胞菌BO3-4（BO3-4）具有两条不同的甲苯降解代谢途径。它利用 *todC1*、*todC2*、*todB* 和 *todA* 基因编码的甲苯双加氧酶（TDO）催化甲苯氧化为顺-甲苯二氢二醇，随后由 *todE* 基因编码的间位开环双加氧酶介导开环反应。另外，BO3-4也可以利用构成二甲苯单加氧酶（XMO）系统的 *xylA* 和 *xylM* 基因介导甲苯侧链的氧化。其代谢途径的多样性赋予了BO3-4在甲苯污染地下水中强大的适应性和高降解效率（Ouyang等，2025）。这些羟基化中间代谢物随后在分子氧的存在下进行开环反应，进入下游代谢途径，最终将化合物矿化为CO?和H?O。

尽管许多分离出的芳香烃降解菌在受控实验室条件下表现出优异的降解能力（Wang等，2025），但其现场表现往往受到环境因素的严重制约。在各种制约因素中，地下水中较低的溶解氧（DO）浓度（通常低于2 mg/L）是对好氧生物修复效果的关键限制（Nebe等，2009）。好氧外源菌氧化1 mg/L的BTEX需要约3.1 mg/L的DO，这种显著的氧亏不仅损害代谢活性，还降低了细菌的存活率，从而降低了原位生物修复的效果。此外，温度不适宜、电子受体和营养物质供应有限、污染物分布不均匀以及与土著微生物群落的拮抗作用等挑战，进一步阻碍了引入的好氧外源菌的活性（Cavazzoli等，2023；Romantschuk等，2023）。例如，大多数能够降解芳香烃污染物的分离菌株在25°C至37°C的温度范围内表现出最佳生长和降解活性（Wongbunmak等，2017），这明显高于温带地区地下水的年平均温度（Pan等，2025）。因此，外源菌在地下水中的存活时间和生物降解活性往往达不到预期，导致原位生物强化失败（Bouchez等，2000）。因此，选择耐冷的好氧芳香烃降解菌并提高地下水DO水平，对于提高外源菌降解BTEX化合物的效率至关重要。

污染物的降解速率不能直接等同于外源菌的效果，因为它还受到土著微生物、地下水波动和土壤吸附的影响（Li等，2024；Lu等，2019）。已有研究表明，追踪功能基因（包括环羟基化甲苯单加氧酶（RMO）、二甲苯单加氧酶（TOL）和TDO）可以指示生物修复过程中微生物分解代谢活性的变化（Li等，2021；Liu等，2022；Wang等，2025）。其他研究报告称，监测苯基琥珀酸、苯基延胡索酸和甲基苯基琥珀酸等代谢物可以为评估土著微生物的降解潜力提供额外证据（Beller，2002）。然而，目前仍然缺乏将功能基因追踪、环境监测和代谢物鉴定相结合来评估外源菌株原位生物强化的现场验证整合性框架（Cavazzoli等，2023；Romantschuk等，2023）。

本研究的目标是：（i）通过BO3-4在甲苯胁迫下的转录组学分析，确定最适合作为原位生物强化现场追踪标志物的关键功能基因；（ii）通过整合污染物动态变化、选定功能基因（*todC1* 和 *todE*）的绝对丰度、甲苯代谢物和微生物群落变化，评估在一个运营型石化场地中生物强化结合间歇曝气处理在现场规模的效果；（iii）确定调控地下水中生物强化效果的主要环境因素，重点关注DO的作用。

# 分节摘要

## 假单胞菌BO3-4在甲苯降解过程中的转录组学分析

为确定作为监测原位生物强化效果分子标志物的关键功能基因，对BO3-4进行了转录组学分析。将菌株接种至100 mL LB培养基中进行活化培养，在20°C、150 rpm轨道摇床条件下培养。通过测定600 nm处的光密度监测细胞生长，直至对数生长后期。然后通过10,000 rpm离心10 min收集细胞，并用无菌0.9% NaCl缓冲液洗涤三次。

### 选择现场追踪基因的功能基因依据

为优先筛选可用于现场部署的原位生物强化追踪标志物，我们对在20°C下以甲苯或柠檬酸三钠为唯一碳源培养的BO3-4菌株进行了转录组分析。共鉴定出4715个表达基因，其中544个为甲苯处理组特异性基因，76个为对照组特异性基因。差异表达分析鉴定出2006个差异基因[Log2倍变率绝对值：log2 FC(abs) ≥ 1]（P < 0.05）（图2a），表明33.97%的注释基因对此作出响应。

# 结论

本研究构建了一套转录组学和分解代谢途径引导的分子标志物及原位追踪系统，用于好氧生物强化技术，其中 *todC1* 和 *todE* 被确定为可在现场部署的功能基因标志物，并已应用于运营型化工厂中甲苯污染含水层的大规模现场追踪。通过将这些标志物的追踪与场地级污染物浓度动态变化相结合，以及在应用中检测到的特征间位开环中间代谢物，

# CRediT作者贡献声明

雷鸣：撰写—初稿、验证、方法论、调查研究、数据管理。潘立旭：撰写—审阅与编辑、验证、方法论、形式分析、数据管理。欧阳吉：撰写—审阅与编辑、可视化。顾飞：撰写—审阅与编辑、可视化。周艳：撰写—审阅与编辑、资源。毛燕杰：撰写—审阅与编辑、资源、调查研究。尹炳奎：撰写—审阅与编辑、资源。崔长征：撰写—审阅与编辑。

# 利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些因素可能影响本文所报告的工作。

# 致谢

本研究得到上海市科学技术委员会（No.23HC1400300）、中国石油天然气集团公司创新基金（No.2022DQ-0504）、上海市生态环境局（No. [2025]27）以及中国石油化工股份有限公司石油化工研究院（Nos. 324036和325094）的支持。作者感谢华东理工大学分析测试中心对样品测量的帮助。

雷鸣 | 潘立旭 | 欧阳吉 | 顾飞 | 周艳 | 毛燕杰 | 尹炳奎 | 崔长征

华东理工大学资源与环境工程学院，生态环境部化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海，200237，中国