氯化消毒对微塑料生物毒性的材料特异性调控：内质网应激及相关健康风险的机制解析

《Journal of Hazardous Materials》：Material-Specific Modulation of Microplastic Biotoxicity by Chlorination: Mechanistic Insights into ER Stress and Associated Health Risks

　　

摘要
氯化消毒（chlorination）是饮用水处理厂广泛采用的消毒方法，研究人员发现其与微塑料（microplastics, MPs）的相互作用可能带来尚未充分探索的健康风险。本研究表明，氯化消毒可诱导四种常见微塑料——聚乙烯（polyethylene, PE）、聚氨酯（polyurethane, PU）、聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene, PTFE）和聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate, PMMA）——发生显著的物理化学变化，重点关注粒径小于30 μm的颗粒。其中，PU和PE MPs表现出最明显的变化，包括显著的表面降解和氧化，并释放多种有机化合物。体外实验显示，消毒后的PU MPs显著增强了细胞毒性，而消毒后的PE MPs通过调控IRE1α/XBP1/BIP通路介导的内质网应激（ER stress）减轻了毒性。在体内实验中，为期30天的原始PE和消毒PU MPs暴露可诱导组织损伤、炎症反应和免疫应答。肝脏转录组学分析揭示脂质、谷胱甘肽和铁代谢紊乱，并激活与内质网应激相关的DNA复制和蛋白酶体通路。mRNA验证实验证实，消毒MPs通过PERK/EIF2α/ATF4通路诱导毒性，其中消毒PU MPs造成最严重的损伤，CHOP显著上调表明细胞凋亡的发生。这些发现强调了消毒MPs的生物毒理学影响，并为优化消毒方法和减轻水处理过程中MPs的健康风险提供了见解，尤其是在全球广泛使用氯化消毒的背景下。

**氯化消毒改变微塑料生物毒性的材料特异性机制：内质网应激及相关健康风险的系统研究解读**

**1. 研究背景与科学问题**

微塑料（microplastics, MPs）是指粒径小于5 mm的塑料颗粒，自2004年首次被定义以来，已成为全球关注的环境污染物。MPs广泛存在于海洋、河流甚至自来水等水生态系统中，据估计全球表层水中MPs颗粒总数超过15万亿。饮用水处理厂（drinking water treatment plants, DWTPs）在降低人类MPs暴露风险方面发挥着关键作用，然而，传统的混凝、絮凝和过滤工艺对粒径小于10 μm的MPs去除效率有限，近50%的小粒径MPs可穿透滤系统进入处理出水中。此外，纤维状和不规则形状的次级MPs比化妆品中的微珠更容易穿越DWTPs的最后处理阶段。氯化消毒作为全球应用最广泛的饮用水消毒方法，其强氧化性可能改变MPs的物理化学性质，导致化学键断裂、表面改性和二次污染物溶出。然而，以往研究主要聚焦于原始MPs的毒性效应，如氧化应激、炎症、细胞凋亡以及生长、繁殖、代谢和免疫功能紊乱等，而对氯化消毒过程如何影响MPs毒性及其潜在机制的认识严重不足。基于此，研究人员选取了四种全球产量大、在饮用水和消费产品中普遍存在且对氯化消毒敏感性各异的MPs——PE、PTFE、PU和PMMA，系统研究了氯化消毒对MPs物理化学性质及生物毒性的材料特异性调控机制，并深入解析了内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ER stress）在其中发挥的核心作用。

**2. 研究技术方法**

研究人员采用多层级技术手段开展系统研究。首先对四种MPs进行模拟氯化消毒预处理，将MPs与氯溶液在25 ℃、120 rpm条件下震荡处理1至4周，其中4周暴露被设计为加速老化场景。采用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）、X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）和X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）表征消毒前后MPs的形态与化学结构变化；采用溶解性有机碳（dissolved organic carbon, DOC）分析和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）鉴定MPs释放的有机化合物。体外实验选用人胚胎肾细胞（HEK293T; RRID: CVCL_0063），通过CCK-8法评估细胞活力，利用XBP1-mNeonGreen NLS基因编码荧光生物传感器检测未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）通路的激活，并通过蛋白质印迹（Western blot）检测ER stress相关蛋白表达。体内实验选用雄性C57BL/6小鼠（6–7周龄，20–22 g），随机分为对照组、原始PE1 MPs组、消毒PE1 MPs组、原始PU1 MPs组和消毒PU1 MPs组（每组n = 3），通过口服灌胃给予100 μL MPs悬液（5 mg/kg/天），持续30天。采用组织病理学（H&E染色）、血液生化分析、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）和RNA测序（RNA-seq）等多维度技术手段，结合GO/KEGG富集分析、加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）和基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），系统解析消毒MPs的体内毒性机制。

**3. 研究结果**

**3.1 氯化消毒触发MPs的物理化学变化与有机化学物质溶出**

SEM图像显示，经4周消毒处理后，PU和PE MPs表现出最显著的结构损伤，包括表面粗糙度增加、裂纹和凹坑的出现；PU MPs出现广泛降解，PE MPs呈现中等程度表面蚀刻；而PTFE和PMMA MPs变化极小，表明其更高的化学稳定性。FTIR分析确认了氧化作用的发生，PE和PU MPs出现新的羰基峰（1,850–1,650 cm^-1和1,800–1,700 cm^-1），羰基指数（carbonyl index, CI）在PU MPs中显著增加。XPS分析进一步揭示了化学修饰细节：PE MPs经消毒后引入O-C=O和O-Na基团，O1s原子含量增加；PU MPs的O1s和N1s含量降低、C1s含量增加，表明脂肪族醚键和N-H键易受氧化攻击，导致链断裂并形成酸酐或过酯基团。XRD分析显示各MPs的特征峰未发生显著位移但结晶度增加，尤其是PU、PE和PMMA，表明聚合物非晶区被选择性降解。DOC释放量呈现材料依赖性差异，PU MPs释放量最高（PU1从389.9 mg/L增至686.3 mg/L），其次为PE、PMMA，PTFE最低（PTFE1仅从18.7 mg/L增至38.0 mg/L）；较小粒径的MPs倾向于释放更高浓度的溶解性有机物。GC-MS分析鉴定出多种释放产物，包括增塑剂和润滑剂等添加剂以及有机中间体和降解产物；PE和PTFE主要释放添加剂（如三甘醇、五甘醇），未检测到降解产物；而PU释放了更多种类的化合物，其中部分被认定为对环境和人类健康有害。

**3.2 消毒MPs通过IRE1α/XBP1/BIP通路介导的ER stress在体外选择性诱导细胞毒性**

CCK-8实验显示，PTFE和PMMA MPs在低浓度（50 mg/L）下表现出最低毒性；PE和PU MPs在消毒后细胞活力显著下降，72 h内活力降低15.2%–35.0%；在200 mg/L浓度下，PE1和PU MPs在48–72 h内细胞活力分别降至71.4%–78.7%和51.9%–77.2%。形态学观察显示细胞出现缩水和变形。利用XBP1-mNeonGreen NLS荧光生物传感器，研究发现消毒PU1 MPs显著诱导ER stress（P < 0.001），而消毒PE1 MPs反而降低了ER stress水平。Western blot和mRNA分析表明，消毒PE1 MPs下调BIP和XBP1s表达，而消毒PU1和PMMA2 MPs显著上调BIP表达；但CHOP表达在各组间无显著变化，说明消毒MPs在体外未触发细胞凋亡。这些结果明确了IRE1α/XBP1/BIP通路是介导消毒PE和PU MPs体外毒性的关键信号通路。

**3.3 消毒MPs在体内诱导组织应激和炎症反应**

为期30天的小鼠灌胃实验显示，原始PE1（P-PE1）组在前14天体质量增长率最低（仅0.08%），消毒PU1（D-PU1）组为4%；至第30天，P-PE1、消毒PE1（D-PE1）和D-PU1组增长率约为7%，显著低于对照组的16.31%；第18天后这些组食物摄入量明显减少。D-PU1组肝脏湿重显著降低（P < 0.05），提示消毒PU1 MPs可能造成肝损伤。外周血分析显示，四个MPs暴露组的白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数均升高，其中D-PU1组升幅最显著，而D-PE1组相对缓和；红细胞、血红蛋白和血细胞比容轻度降低。组织病理学分析显示MPs暴露导致肠道绒毛结构紊乱、黏膜下水肿、淋巴细胞浸润和隐窝萎缩，肝脏出现解毒功能受损、肝细胞疏松、充血和间质水肿，肾脏出现肾小管扁平化、肾小球扩张和免疫细胞浸润。肝损伤生物标志物检测表明，与原始MPs相比，消毒PE1 MPs使天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）分别降低49.25%和27.19%，而消毒PU1 MPs使AST和ALT分别升高12.46%和53.06%。免疫毒性评估显示，D-PU1组基质金属蛋白酶12（MMP12）活性以及血清补体C3a、C5a和促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平显著升高，其中TNF-α表达较对照组升高28倍（P < 0.001）；而D-PE1 MPs则缓解了这些效应。

**3.4 消毒MPs暴露导致肝脏损伤的基因水平机制**

RNA-seq分析显示，P-PE1组和D-PU1组表现出最多的差异表达基因（DEGs）（P-PE1：648个上调、1,001个下调；D-PU1：690个上调、976个下调）。GO和KEGG富集分析表明，D-PU1组的DEGs富集于脂质代谢、催化活性和膜相关过程，揭示脂质过氧化（LPCAT3、ACSL4）、谷胱甘肽合成（SLC3A2、GCLC）和铁稳态（FTH、FTL）的紊乱。KEGG分析显示，原始PE1 MPs主要与细胞增殖、凋亡和PI3K-Akt信号通路相关，而消毒PU1 MPs则富集于化学致癌、DNA复制和外源物代谢通路。WGCNA分析鉴定出12个基因模块，其中蓝绿色模块（1,570个基因）与P-PE1 MPs显著相关（R² = 0.579, P = 0.0237），富集于DNA复制和修复通路；绿色模块（336个基因）与D-PU1 MPs显著相关（R² = 0.694, P = 0.0041），富集于蛋白质输出通路。GSEA进一步证实，原始PE1和消毒PU1 MPs组均显著上调DNA复制和蛋白酶体通路，提示这两类MPs的毒性机制均与ER stress相关：MPs首先触发炎症反应，诱导DNA损伤和组织损伤；为维持基因组稳定性和组织修复，DNA复制被激活，同时UPR辅助蛋白质折叠和分泌；当UPR激活后，错误折叠蛋白通过内质网相关降解（ER-associated degradation, ERAD）途径输出，并由泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）降解。然而，在持续应激条件下，这些系统可能不堪重负，最终导致细胞凋亡。

**3.5 消毒MPs在体内诱导ER stress中PERK/EIF2α/ATF4通路的激活**

RNA-seq数据分析显示，D-PU1组中UPR起始因子BIP显著上调，而D-PE1组BIP表达下调；IRE1α和XBP1s呈现与BIP一致的变化趋势，磷酸化IRE1α（p-IRE1α）水平升高，JNK2上调，表明IRE1信号通路激活并可能介导细胞凋亡。PERK/EIF2α通路同样被激活，P-PE1和D-PU1组PERK和EIF2α表达增加；Western blot证实D-PU1 MPs暴露的肝细胞中PERK和EIF2α蛋白水平升高，而D-PE1组较原始组降低。然而，ATF4和CHOP等其他下游靶标变化较小，ATF6通路未见显著改变。RT-qPCR验证结果与转录组数据一致：D-PU1组IRE1α/XBP1s/BIP基因显著上调，D-PE1组被抑制；PERK通路相关基因（EIF2α、ATF4）在P-PE1和D-PU1组升高，在D-PE1组降低；值得注意的是，仅D-PU1组CHOP表达显著增加，表明长期暴露下消毒PU1 MPs具有显著促凋亡毒性。内质网伴侣蛋白GRP94、PDIA6和ERdj4在P-PE1和D-PU1组显著上调，EDEM在这些组中表达也显著升高，凸显其在ERAD通路中识别和去除错误折叠糖蛋白的关键作用。综合而言，IRE1α/XBP1s/BIP通路在PE MPs暴露组中占主导，而PERK/EIF2α/ATF4通路在PU MPs暴露组中被强烈激活并导致细胞凋亡。

**4. 结论与展望**

本研究首次系统揭示了氯化消毒对微塑料生物毒性的材料特异性调控机制。氯消毒可改变MPs的物理化学性质，其中PE和PU MPs表现出最显著的表面氧化和降解；消毒后PU MPs显著增加细胞毒性、炎症反应和肝损伤，而消毒后PE MPs通过IRE1α/XBP1/BIP通路减轻了ER stress且未触发细胞凋亡。转录组学和分子分析揭示了不同的ER stress机制：PE MPs以IRE1α/XBP1/BIP通路为主，而PU MPs强烈激活PERK/EIF2α/ATF4通路并导致细胞凋亡。这种截然相反的结果源于PU的可水解酯键/氨基甲酸酯键与PE的不可水解C-C主链之间的本质差异，表明聚合物主链化学性质决定了氯化消毒是增强还是减轻MPs毒性。鉴于氯化消毒在全球DWTPs中的广泛使用，消毒MPs可能对全球数十亿人构成潜在健康风险。优化水处理工艺以减少次生污染物、探索兼顾效率与安全性的替代消毒方法，以及将MPs毒性评估纳入监管框架，是保障公共健康的关键后续步骤。